Axa prioritară 2: Competitivitate prin Cercetare, Dezvoltare Tehnologică şi Inovare
Operaţiunea: 2.2.1: Dezvoltarea infrastructurii CD existente şi crearea de noi infrastructuri CD (laboratoare, centre de cercetare)
ID / Cod SMIS CSNR 1882 / 49159
Contract de finanţare nr. 633 / 11.03.2014

MODERNIZAREA INFRASTRUCTURII INCD VICTOR BABEŞ PENTRU CERCETARE AVANSATĂ ÎN MEDICINA CELULARĂ ŞI MOLECULARĂ
-CAMED-

Proiectul CAMED are ca obiectiv principal achizitia tehnologiei de ultima generatie pentru crearea unei platforme de cercetare avansata biomedicala cu 4 laboratoare de cercetare complementare care permit aplicarea noilor strategii de cercetare ‚network medicine'. Vor fi achiztionate 12 echipamente de ultima generatie cu valoare mai mare de 100.000 euro. Principalele performante ale acestor echipamente sunt detaliate mai jos pentru fiecare laborator.

A. LABORATORUL DE BIOIMAGISTICA

Instalarea primului cryo-electrono-microscop (Cryo-EM) 200keV/XFEG care va fi folosit in cercetarea biomedicala conform standardelor impuse de tehnica presupune extinderea unei cladiri. Pentru instalarea noului microscop electronic si a anexelor acestuia a fost aleasa ca solutie constructiva extinderea cu o constructie usoara a cladirii in care este amplasat microscopul existent. Suprafata nou construita (extindere de 80 mp) va gazdui atat microscopul cat si echipamentele de prelucrare la temperaturi foarte scazute, -180°C. Pregatirea probelor de microscopie electronica la temperaturi scazute necesita achizitia urmatoarelor echipamente si sisteme de prelucrare a probelor: Sistem de vitrificare robotizat pentru probe biologice (Automatic Plunge Freezer); Sistem de vitrificare a probelor la presiune inalta (High pressure freezing system); Cryo-ultramicrotom pentru taierea sectiunilor fine din probele vitrificate pentru examinare cryo-EM; Sistem de acoperire cu straturi conductoare (High Vacuum Carbon Coater) pentru depozitarea suportului de carbon pe grilele de microscopie electronica, iar in cazul anumitor experimente, a unor metale grele (Pt, Au) pentru cresterea contrastului macromoleculelor studiate, etc. Acestea vor fi amplasate in noul spatiu construit special prin extinderea corpului C3, in vecinatatea microscopului. MICROSCOP ELECTRONIC DE TRANSMISIE 200KV/xFEG CRYO-EM/CLEM (inexistent in RO). Acest sistem cu tehnologie hibrida, de inalta clasa tehnologica permite: analiza ultrastructurala cu inalta rezolutie (rezolutie – 0,18 nm) datorita sistemului FEG (Field Emission Gun) care permite cresterea coerentei fasciculului de electroni; tomografia unor sectiuni/celule de pana la 0.5 micrometri grosime (reconstructia tridimensionala a structurilor biologice cu rezolutie subnanometrica); analiza ultrastructurala a probelor biologice criofixate (fara prelucrare chimica – fara artefacte) prin expunere la un doza redusa de electroni (tehnica low-dose); achizitia si analiza directa a semnalului fluorescent in experimentele de microscopie corelationala (sistem de fluorescenta camp larg); tomografia particulelor aflate in suspensie (virale, proteice, complexelor moleculare, organite celulare); accesul unor utilizatori cu niveluri diferite de experienta in manevrarea microscopului: student/mediu/specialist (folosire in sistem 'open-access' cu asistenta tehnica); poate fi folosit in diferitele moduri de lucru (temperaturi scazute/tomografie/fluorescenta, etc) datorita unor programari specifice pe diferite module de lucru ceea ce reduce timpul de lucru; permite consultarea specialisti din strainatate in timp real (tele-diagnostic); permite intreventia si up-gradarea rapida, de la distanta a probleme tehnice ce pot apare in timpul utilizarii (mentenanta si service fara deplasare de personal/costuri reduse). DETECTOR DIRECT DE ELECTRONI (DDD) CU SENZOR CMOS (inexistent in RO) foloseste o tehnologie noua de captare a imaginilor (CMOS technology) de microscopie electronica cu o rezolutie maxima pentru sistemele digitale de achizitie existente (4kx4k), reducand artefactele si pierderea de informatie; zgomotul de achizitie a imaginilor este redus datorita senzitivitatii crescute a sitemului CMOS analog si pixel size 14x14µm2 face posibila observarea probelor prelucrate cryo cu contrast foarte scazut, 400 cadre/sec, cu capacitate de integrare si numarare a electronilor detectati. SISTEM DE CRIOFIXARE LA PRESIUNE MARE (inexistent in RO) - esential in procesarea probelor pentru tehnicile de Cryo-EM, permite criofixarea (-180°C) celulelor vii in stare nativa si a probelor de tesut mai groase (fragmente de pana la 1 mm grosime); fixarea ultrapida la presiune inalta (600-2.300 bar) genereaza cristale mici de apa (10-15 nm) care nu altereaza structura celulara - minimum de artefacte; probele biologice crio-fixate pot fi studiate direct la microscopul electronic prevazut cu holder Cryo-EM; pot fi crio-sectionate (ultramicrotom cu sistem de criosectionare – de achizitionat); sau pot fi incluse in rasini prin crio-substitutie (sistem existent in LPU). ULTRAMICROTOM CU INCINTA DE CRIOSECTIONARE - esential in procesarea rapida a probelor pentru tehnicile de Cryo-EM; permite sectionarea probelor (celule sau tesut) cryo-fixate la temperaturi scazute (-180°C) fara formarea cristalelor mari de gheata in proba (cristale sub 10 nm); permite transferul sectiunilor efectuate in holderul Cryo-EM. Achiziţia unor echipamente de înaltă clasă tehnologică şi construirea laboratorului de biomagistică celulară şi moleculară de super-rezoluție va permite investigarea celulelor şi ţesuturilor în ‚stare nativă' esenţială în înțelegerea proceselor celulare la nivel molecular. SEPARATOR DE CELULE cu 5 lasere de excitare (inexistent in RO) - permite separarea cu mare precizie a celulelor marcate fluorescent prin citometria de fux simultan cu 5 lasere de excitare (spectru larg 375-642 nm); are ca performante unice - 20 de detectori de fluorescenta care permit marcarea simultana si discriminarea a 18 markeri de selectie, ceea ce ofera utilizatorului o gama foarte mare de combinatii posibile in alegerea colorantilor fluorescenti si a markerilor de interes; utilizarea simultana a unui numar mare de markeri reduce timpul si costurile izolarii si, important, ofera posibilitatea selectarii cu mare acuratete a unei categorii de celule rare (cum sunt celulele stem, telocite, celule imune, etc); si poate evalua pina la 70.000 de celule/secunda, impact pozitiv asupra pastrarii nealterate a proprietatilor celulare si a viabilitatii.Studiile experimentale cu impact stiintific semnificativ atit in cercetarea fundamentala cit si (pre)clinica sunt cele care utilizeaza celule primare in culturi omogene pornind de la tesuturi si organe (amestec heterogen de celule). Metodele moderne de purificare a celulelor de interes presupun marcarea lor fluorescenta cu markeri specifici urmata de sortarea lor in baza acestor markeri si analiza lor in Cryo-EM sau MSR. Aparatul propus spre achizitie indeplineste aceasta activitate de sortare a celulelor, iar performanta aparatului este esentiala in determinarea succesului studiilor experimentale. In centrul Universitar Bucuresti mai exista doua separatoare celulare cu performate mult inferioare (1 laser, numar mic de detectori). MICROSCOP CONFOCAL CU SISTEM DE SUPER-REZOLUTIE – MSR (inexistent in RO) are un sistem integrat de microscopie confocala cu sistem de super-rezolutie; permite studii pe celule vii, permite experimente de co-localizare cu o larga varietate de fluorocromi utilizand o sursa de lumina alba (numar nelimitat de lungimea de unda a excitatorului ca in cazul unui microscop confocal conventional) (ajunge la rezolutie spatiala de 50-60 nm (mult peste rezolutia optica normala de 200 nm specifica microscoapelor obisnuite). MSR avut in vedere impune re-amenajarea unor camere pentru gazduirea unui microscop de super rezolutie de ultima generatie si a anexelor sale (sursa de curent neintreruptibila, server stocare date, stati de prelucrare grafica). Ca si in cazul microscopului electronic, sunt necesare sisteme speciale de climatizare si sisteme anti-vibratie active (masa antivibratie). Avand in vedere necesitatea efectuarii experimentelor de MSR pe celule vii si CLEM pe celule in stare nativa, cat mai apropiate de conditiile in vivo sau din cultura, este necesara re-amenajarea a 2 incaperi pentru culturi celulare in imediata vecinatate a MSR si echipamentelor de Cryo-EM. Echipamente necesare in laboratorul de culturi celulare: hota cu flux laminar orizontal; incubatoare; microscoape optice inversate cu camera de incubare pentru celule atasata; centrifugi de mici dimensiuni (12-15.000xg); etc. ECOCARDIOGRAF PENTRU ANIMALE MICI Ecocardiograful este necesar pentru evaluarea complexa a functiei cardiace la animalele de laborator. Astfel, in cadrul proiectului de fata, ne propunem intelegerea mecanismelor fiziologice de regenerare si reparare miocardica, ce ne poate ajuta pe viitor la introducerea unei noi linii terapeutice: tratamentul cu celule. Recent descrise, telocitele reprezinta un tip special de celule interstitiale cu prelungiri specifice, extrem de lungi, numite telopode. Ele au fost evidentiate cu ajutorul microscopiei electronice in variate organe cavitare si non-cavitare, inclusiv in cord la nivelul endocardului, miocardului si epicardului, atat la oameni, cat si la mamifere. Telocitele formeaza o retea in care sunt asamblate toate celule cardiace, in acest fel asigurand probabil coordonarea tuturor semnalelor celulare, cu rol esential in reinnoire, regenerare si reparare. Consideram ca telocitele reprezinta elemente de regenerare si ca numarul si aspectele functionale se coreleaza cu ameliorarea hemodinamica demonstrata prin ecocardiografie. Este stiut faptul ca examinarea ecografica de inalta rezolutie, cu ajutorul tehnicilor noi de ‚speckle tracking', deceleaza gradul de hipertrofie si fibroza miocardica. Astfel, ne propunem sa evaluam rolul morfofunctional al telocitelor cardiace post infarct miocardic experimental, prin folosirea si corelarea metodelor ecocardiografice noi de evaluare a functiei cardiace cu aspectele morfologice din modelele experimentale.

B. LABORATORUL DE HISTOLOGIE/IMUNOHISTOCHIMIE Spatiile in care vor fi gazduite noile echipamente vor fi modernizate conform cerintelor impuse de acestea (reamenajarea a 614,11 mp – reprezentand primul etaj al corpului C1 al INCDVB). In procesul de modernizare vor fi facute recompartimentari pentru asigurarea calitatii fluxurilor de lucru. Datorita numarului mare de probe prelucrate in acest laborator (aproximativ 10.000 cazuri cu patologie tumorala, 100.000 lame/an) se impune arhivarea digitala a imaginilor obtinute pentru a putea fi utilizate in studii de cercetare transfrontaliere. Din aceste motive se impune inlocuirea unor echipamente mai vechi, de eficenta scazuta, si achizitia a doua sisteme moderne, dedicate scanarii la rezolutie maxima a lamelor obtinute in analiza hitopatologica/imunohistochimica si a celor cu markeri fluorescenti (FISH). Se impune de asemenea achizitia unor echipamente noi care vor permite o prelucrare rapida, eficienta si de inalta calitate a unui numar mare de probe: sisteme de includere, procesare, imunostainere, microscoape cu sisteme integrate de achizitie, calculatoare, etc. Prelucrarea probelor de histopatologie/imunohistochimie la standarde internationale permite in plus folosirea acestora pentru analiza moleculara, genetica sau proteomica in studii transnationale pentru diferite tipuri de tumori. Crearea unei arhiva digitale va permite obtinerea unor informatii pretioase in identificarea markerilor specifici tumorali si a unor agenti terapeutici tintiti la nivel molecular. SISTEM DE SCANARE AUTOMATA A LAMELOR este un echipament de mare capacitate (peste 300 lame/24h) pentru lame de dimensiuni variate (micro si macrosectiuni). Viteza de scanare a unei lame este de 60 sec. Se opteaza pentru configuratia complet functionala incluzand toate accesoriile necesare (monitor , tastatura, sisteme de filtrare, sisteme de incarcare a lamelor, software-uri si licente). Crearea unei baze de date cu lame virtuale poate fi folosita in studii retrospective si prospective care pot genera informatii pretioase in cercetarea patologiei tumorale. SISTEM DE SCANARE LAME CU SOFTWARE DE INTERPRETARE PENTRU IHC, FISH SI FLUORESCENTA (inexistent in RO) contine un microscop automatizat; cu functionare in camp luminos, lumina transmisa si fluorescenta; are capacitate de scanare tiling 4 -8-200 lame, viteza de scanare 1lama/minut, cu sofware dedicat FISH, IHC pentru interpretare si prediagnosticul cancerului de san si FISH, si cu sistem integrat automatizat pentru managementul intensitatii in fluorescenta si creare de lame virtuale prin metoda stitching.

C. LABORATORUL DE PATOLOGIE MOLECULARA Acest laborator functioneaza intr-un spatiu recent modernizat si implica doar achizitia de echipamente, mobilier si refacerea sistemelor de climatizare care sa respecte normele (temperatura/dust free/control nivel de ozon/ viteza flux de aer, etc) impuse de noile aparate. SISTEM AUTOMAT INTEGRAT DE SECVENTIERE ‚next generation', reprezinta o tehnologie de noua generatie (5 sisteme exista deja in Romania), cu cipuri semiconductoare, care masoara direct modificarile de pH ce au loc in reactiile de secventiere pt. 200-400 perechi de baze. Sistemul permite aplicatii multiple de secventiere cum ar fi: experimente multiplex (reduc costurilor de analiza), diagnosticul a peste 700 de boli ereditare (prin evaluarea a 300 de gene din 30 ng DNA genomic) si a 45 de oncogene si gene de supresie prin detectarea a peste 700 de mutatii intr-o singura reactie din 10 ng DNA utilizand un kituri prevalidate de diagnostic genic, secventiere genom mitocondrial, small RNA si transcriptom, si genom microbial, experimente de expresie genica si genomica functionala, accesarea Bibliotecii RNAseq . Desi in Romania exista deja aproximativ 5 sisteme de secventiere NGS, evolutia tehnologica rapida din acest domeniu justifica pe deplin completarea platformelor de genomice existente cu echipamente de ultima generatie. Investigatiile genomice vin in completarea studiilor histopatologice, imunhistochimice, moleculare, proteomice si structurale. SCANNER ADN MICROARRAY DE INALTA REZOLUTIE – platforma deschisa, completa si integrata, avand multiple aplicatii pentru analiza genomica structurala si functionala: cariotipare moleculara prin hibridizare comparativa genomica bazata pe microarray (array based comparative genomic hybridization - array-CGH), expresie genica, analiza de exoni, analiza profilului microARN, studii de metilare ADN, studii asupra interactiilor ADN – proteine prin imunoprecipitarea cromatinei pe chip (Chromatin Immunoprecipitation - ChIP-on-chip), analiza polimorfismelor mononucleotidice (single nucleotide polymorphism –SNP) pentru cartografierea regiunilor de disomie uniparentala/ pierderea heterozigotiei (copy neutral loss-of-heterozygosity – CN-LOH). Scanner microarray de ultima generatie, cu o rezolutie de scanare mergand pana la 2 microni, permitand scanarea de lame cu densitate mare de sonde si o limita de detectie joasa, pentru a asigura identificarea semnalelor slabe (ex: gene cu expresie scazuta). Scannerul, prevazut cu autofocalizare dinamica, permite ajustarea continua a focalizarii in timpul scanarii, iar detectorul prezinta posibilitatea de ajustare a nivelului semnalelor de la 100 % la 1 %. Scanerul asigura un flux continuu de lucru, fara intreruperi (lamele de microarray pot fi introduse in scanner pentru citire chiar si in timp ce acesta functioneaza) si are un sistem integrat pentru protectia probelor impotriva degradarii cauzate de factori externi (sistem de protectie impotriva ozonului). Toate operatiunile de control se efectueaza automat; software de control al instrumentului, de extragere a datelor (cu generarea unor rapoarte de calitate ce permit verificarea etapelor de lucru - marcare probe, hibridizare si scanare lame) si software de analiza a datelor. Datele genetice/genomice pot fi corelate cu cele de proteomica (laborator biochimie), de structura si de localizare a proteinelor studiate (laborator bioimagistica).

D. LABORATORUL DE BIOCHIMIE Modernizarea acestui laborator implica doar achizitia de echipamente dintre care mentionam: SISTEM MICROARRAY PENTRU ACIZI NUCLEICI SI PROTEINE de inalta rezolutie si inalta densitate; prevazut cu 6 lasere, patru surse interne de excitare: 488 nm, 532 nm, 594 nm, 635 nm; are inalta performanta in recunoasterea pozitiei si detectarea fiecarui spot; platatforma deschisa, ce permite scanarea/analiza oricarui tip de lama; permite scanarea cu rezolutie reglabila intre 2,5 si 100 micron/pixel, rezolutia digitala este 16 biti, iar citirea unei lame in intregime, excitata de o singura sursa, la rezolutie de 10 µm/pixel dureaza maxim 4 minute; cu softwares de control si analiza. Scannerul pentru protein microarray in aceasta varianta de ultima generatie va fi utilizat pentru detectia de inalta rezolutie a pana la 10.000 de spoturi (proteine) /lama pentru detectia simultata dintr-o singura proba biologica. Echipamentul va putea detecta simultan in functie de fluorocromii utilizati in aceeasi proba variante modificate post-translationale ale aceleiasi proteine, modificari care pot fi asociate unei patologii specifice. In plus echipamentul va putea fi utilizat si pentru studiile de transcriptomica in care pornind de la imprintarea unei secvente specifice nucleotidice va putea fi generata in situ proteina de referinta. Metodologia de transcriptie in situ va reproduce astfel in detaliu eventualele procese patologice dezvoltate la nivel molecular in procesul pos-transcriptional. Datele de proteomica functionala pot fi corelate cu cele de genetica (lab. patologie moleculara), cu structura tridimensionala a proteinelor analizate si cu localizarea lor cu precizie nanometrica in context celular (laborator bioimagistica). Modernizarea infrastructurii de cercetare existente va permite:

• dezvoltarea capacitatii de investigare bioimagistica celulara si moleculara de super-rezolutie, in acord cu tendintele de cercetare pe plan european (studii de biologie structurala, crio-electrono-microscopie, microscopie corelationala);

• dezvoltarea metodologiilor de investigare moleculara si genica;

• dezvoltarea metodologiilor de investigare proteomica de inalta rezolutie.

Modernizarea spatiilor de cercetare la standardele cerute de noile echipamente va fi facuta pe o suprafata de 693,61 mp din care 80 mp vor reprezenta extinderea unui spatiu de cercetare. Prin realizarea acestui proiect vor putea fi create cel putin 12 posturi noi in cercetare in INCDVB. Noua infrastructura este gandita ca o platforma tehnologica integrata, cu utilizatori multipli, in sistem open access. Din acest motiv, 5 posturi sunt prevazute pentru pozitii de cercetare in tehnologiile nou achizitionate iar personalul angajat va urma cursuri de pregatire avansata in folosirea echipamentelor de ultima generatie. In acest fel, va fi adaugata o resursa umana de mare valoare care va acorda asistenta utilizatorilor interni sau externi si va putea contribui la imbunatatire noilor tehnologii.