Proiect nr. 42 / 2005

Titlu Noi tinte celulare si moleculare  in terapia  cu orientare spre pacient  a tumorilor maligne. O abordare genomica si proteomica (TIN)

Program: CEEX

Domeniu: Sanatate

Autoritatea contractanta: VIASAN

Durata: 36 luni

Bugetul proiectului: 1.404.000.. (de la bugetul de stat)

CO: Institutul Național de Cercetare-Dezvoltare în Domeniul Patologiei și Științelor Biomedicale “Victor Babeș”

MINISTERUL SANATATII

INSTITUTUL NATIONAL DE CERCETARE-DEZVOLTARE IN DOMENIUL PATOLOGIEI SI STIINTELOR  BIOMEDICALE

 “VICTOR BABEȘ”

www.ivb.ro

 

www.vbabes.ro

 
 


                                                    

 

Splaiul Independenței  99-101, Sector 5, 050096 Bucuresti, ROMANIA

Tel. 40-21-319.27. 32; 319.27.34; 3.19.45.30, Tel/fax 40-21-319.45.28 , E-mail: info@vbabes.ro

 

Director de proiect:

Sectia Histopatologie, Laborator Anatomie Patologica, INCD Victor Babes

Tel: 021-319 45 28, e-mail: carmena@vbabes.ro

Parteneri

P1 -  U.M.F. “Carol Davila” –  Catedra de Medicina Celulara si Moleculara

P2 -  Institutul Oncologic “Al. Trestioreanu”

P3  - Universitatea de Medicina si Farmacie “Gr. T. Popa ”

P4  - Universitatea de Medicina si Farmacie “Ovidius”

P5 – Universitatea de Medicina si Farmacie „Carol Davila”  Catedra de Hematologie

P6 - Spitalul Clinic “Sf. Maria”

P7 – Geneticlab

Px – Institutie, responsabil stiintific

 

Rezumatul proiectului

Transferarea rezultatelor ceercetarii in tratarea afectiunilor majore: cancer, boli cardiovasculare, diabet, obezitate, boli rare si alte afectiuni cronice (ex.osteo- artritele).Urmarind dezvoltarea strategiei de orientare spre pacient de la preventie pana la diagnosticare si tratament, inclusiv cercetarea clinica

Cancerul ramane inca una dintre bolile care constituie o problema majora de sanatate in lumea intreaga. Noile strategii terapeutice sunt orientate in special pe tinte specifice la nivel molecular, inclusiv expresia unor proteine, amplificari si mutatii genice. Intre noii agenti specifici antitumorali pot fi enumerati: anticorpii umanizati, inhibitorii receptorilor factorilor de crestere, antagonistii factorilor de transductie a semnalelor, vectori de clonare, vaccinurile cu celule prezentatoare de antigene. Exista un interes crescand pentru introducerea lor in terapie, asociate sau nu chimioterapia. Cercetarea asupra identificarii unor noi agenti antitumorali are un profund "caracter translational", oferind clinicianului biomarkeri diagnostici si prognostici specifici, cu implicatii asupra evolutiei tumorilor, raspunsului la tratament si supravietuirii. Diagnosticul patologic (imbunatatit in prezent prin tehnici de biologie moleculara aplicate pe tesuturi umane) ramane de importanta cruciala in preventia, diagnosticul si monitorizarea terapiei tumorilor maligne.

TIN presupune cercetarea in colaborare multidisciplinara in domeniul oncologiei, utilizand potentialul actual oferit de genomica structurala, pentru aplicatii in sanatatea umana, si pentru transferul cunostintelor fundamentale in domeniul aplicarii clinice; aceasta pune in evidenta o caracterizare trans-structurala (imunofenotipica, genomica si proteomica) a tipurilor de tumori maligne la pacientii susceptibili pentru o terapie personalizata, scopul fiind imbunatatirea evolutiei clinice prin orientarea pe noile terapii de prevenire, diagnostic si monitorizare terapeutica.

Vor fi examinate urmatoarele potentiale tinte moleculare: Topoizomeraza II A (TOP IIA), Her-2/neu si biomarkeri angiogenetici (EGFR, VEGF, VEGFR), amplificarea lor genica urmand a fi identificata in cancerul mamar si vezical; ARNm al proteinei genei c-kit (CD117) si mutatiile genice vor fi determinate in tumorile stromale extragastrointestinale (extraGISTs) si in carcinoamele pulmonare cu celula mica (SCLC); CD20 si CD52 vor fi determinate in bolile limfoproliferative cronice cu celula mica B refractare la tratament; CD30 si ALK vor fi testate in limfoamele maligne anaplazice prin dozarea proteinei ALK prin 2-D SDS-PAGE; NF-kB, COX 2 si proteina latenta de membrana (LMP) vor fi evidentiate imunohistochimic in carcinoamele capului si gatului, legat de identificarea genomului EBV. Mutatiile genei BRCA1 si profilul genic tumoral vor fi efectuate in unele carcinoame mamare. Ca metode principale de cercetare vor fi utilizate imunohistochimia, hibridizarea in situ, hibridizarea in situ cu fluorescenta, PCR, Real –time PCR , si pentru unele  proteine, electroforeza 2-D.

Scopul TIN este obtinerea de noi parametri pentru identificarea pacientilor cu un beneficiu real la noii agenti terapeutici si reducerea astfel a terapiilor costisitoare si ineficiente. Vor fi comparate date din zone geografice si socio-economice diferite din Romania, dat fiind faptul ca diferite cancere se pot asocia cu variati agenti exogeni.

Folosirea tehnologiilor avansate furnizate de studiile de genomica structurala asupra unor tinte moleculare noi, TIN va imbunatati diagnosticul precoce; identificarea de gene si a proteinelor codificate ca si potentiale tinte terapeutice reprezinta o baza importanta pentru dezvoltarea terapiilor adaptate fiecarui pacient.

Obiectivele generale si specifice ale proiectului

Obiectiv stiintific general al proiectului a urmarit transferul cercetarii fundamentale  din domeniul cancerului in cel al terapiei acestei boli majore  cu accent pe caracterizarea  unor noi tinte celulare si  moleculare,  in dezvoltarea strategiei de orientare  spre pacient, de la preventie, la diagnostic si tratment, cu implicatii in cercetarea clinica.

Obiective stiințifice specifice

1.Alcatuirea loturilor de studiu pe baze clinico-morfologice si statistice, selectarea si aplicarea preliminara a metodelor de analiza  histopatologica (HP), imunohistochimicia  (IHC) si moleculara ISH, FISH).

Stabilirea categoriilor de tumori cu supraexpresia unor proteine transductoare de semnal sau cu prezenta unor gene structurale cu valoare diagnostica poate stabili bazele unei terapii tintite si  urmareste alcatuirea unor loturi de studiu omogene care sa permita o analiza retrospectiva cat mai corecta, cu posibilitatea unor evaluari statistic semnificative si cu potential  de aplicare clinica rapida, inscrise in cerintele cercetarii translationale.

2.Evaluarea pattern-ului morfologic al unor tumori maligne cu histogeneza diferita, selectate pe baza analizei HP si completarea panelului de anticorpi; determinarea imunofenotipului ultrastructural in vederea completarii caracterizarii morfologice a unor tumori selectate.

3.Completarea orientarii diagnostice prin stabilirea profilului proteomic  tisular cu ajutorul imunohistochimiei (IHC) si a electroforezei  in cazul unor tumori selectate, precum si marcarea unor tinte moleculare genice prin reactii de ISH, FISH si CISH.

4.Analiza calitativa, semicantitativa si statistica a distributiei biomarkerilor utilizati in chimiopreventia tumorilor maligne selectate si stabilirea unor mutatiigenice cu alcatuirea unor profiluri de genomica structurala prin PCR si Real-time PCR.

5.Determinarea profilului genic prin cDNA microarray pentru tumori maligne selectate pe baza pattern-ului HP, a imunofenotipului si caracterelor moleculare, in vederea completarii caracterizarii tintelor moleculare ale terapiei individualizate.

6.Coroborarea  datelor clinice, morfologice, IHC/proteomice si de genomica structurala cu comportamentul biologic al tumorilor tratate conventional sau prin terapie specifica tintita; evaluarea rezultatelor procesului de urmarire clinico-terapeutica

Raportul final de activitate 

Activitatile etapei 1 au  inclus documentare privind biomarkeri verificati pe trialuri clinice, a caror utilizare este acceptata de practica medicala si analiza unor noi categorii de proteine si gene implicate in transductia semnalelor, cu posibile aplicatii prognostice si terapeutice.

A fost realizata documentarea privind biomarkeri tisulari verificati sau in curs de verificare pe trialuri clinice (de ex. Her-2/neu) pentru anumite tumori si au fost analizate noi categorii de proteine  codificate  de gene implicate in mecanisme de transductie a semnalelor, ca potentiale tinte terapeutice.

A fost intocmit astfel un material bibliografic referitor la  tipuri de biomarkeri cu valoare prognostica sau predictiva si  posibile implicatii in terapia specifica (Co,P2-P8).

 

Activitatile etapei a 2-a  au  inclus analiza coexpresiei  imunofenotipice  a proteinelor unor gene cu valoare prognostica sau implicatii terapeutice in tumori mamare (TOP2A, Her-2/neu, EGFR) si a  expresiei unor  biomarkeri (NF-kB, LMP/EBV, VEGF, VEGFR, CD117, CD56, NK1, CD34, Actina, Proteina S-100, Nestina, Tau etc.)  in caracterizarea diferentierii unor tumori si analiza unor noi categorii de proteine si gene implicate in transductia semnalelor, cu posibile aplicatii prognostice si terapeutice (P1,P2,P4,P5).

A fost realizata analiza expresiei oncoproteinei cerbB2 in tumori mamare si  vezicale  in corelatie cu expresia proteinei TOP2A si cu cea a unor factori angiogenetici (EGFR),  proteine  codificate  de gene implicate in mecanisme de transductie a semnalelor si  potentiale tinte terapeutice (P1, P4).

A fost determinata expresia factorului nuclear de transcriptie NF-kB in tumori nazo-faringiene  in asociere cu prezenta unor componente proteice ale virusului Epstein-Barr (LMP) ca  tipuri de biomarkeri cu valoare prognostica sau predictiva si  posibile implicatii in terapia specifica.

Au fost de asemenea analizate unele limfoame maligne nonHodgkin difuze cu celule mici  in vederea analizei caracterelor morfologice si IHC asociate cu rezistenta la terapie.

Tumorile pulmonare selectate (P1, P5)au cuprins carcinoame si adenocarcinoame la care a fost determinata expresia unor factori angiogenetici in corelatie cu expresia proteinei cerbB2 si a CD117.

Tumorile extraGIST (P1,P5) au fost selectate dintr-o serie de tumori de tip stromal  CD117 pozitive, fiind analizate in paralel cu alte tumori CD117 pozitive nonstromale (disgerminoame, seminoame, melanoame), prin intermediul unor noi paneluri (CD34, Actina, Proteina S-100, Nestina, Tau).

Au fost completate  panelurile de anticorpi pentru tumori mamare, tumori vezicale, extraGIST,  carcinoame pulmonare,  LMNH , carcinoame de cap-gat ( (Top-2A, Her-2/neu, EGFR, VEGF, VEGFR, CD117, CD20/L26, CD45RO/UCHL1, CD30, COX2 etc.).

Au fost testate IHC diferite tumori maligne pulmonare  (Cromogranina A, CD56, NK1), in vederea selectarii  cazurilor pentru determinarea imunoelectronofenotipului de tip neuroendocrin (P1).

A fost  investigata  posibilitatea analizei  proteomului in conditii normale si in tumori prin electroforeza bidimensionala. A fost efectuata verificarea parametrilor pentru electroforeza verticala in gel de poliacrilamida- SDS (P1).

A fost efectuata analiza HP si IHC pentru determinarea micrometastazelor in ganglionii santinela  in cazuri selectate de tumori mamare (P1,P3).

 

Activitiatile etapei a 3-a. Activitatile efectuate au constat in stabilirea configuratiei IHC si a substratului molecular (ISH, FISH) a unor tumori mamare si vezicale selectate (P1,P4, P5). A fost realizata analiza expresiei oncoproteinei cerbB2 in tumori mamare (carcinoame ductale invazive) si tumori vezicale infiltrative cu sau fara metastaze limfoganglionare,  in corelatie cu expresia proteinei TOP2A si cu cea a unor factori angiogenetici (EGFR, VEGF, VEGFR1, VEGFR2),  proteine  codificate  de gene implicate in mecanisme de transductie a semnalelor si  potentiale tinte terapeutice. Determinarea amplificarii genice prin FISH a fost realizata la tumori cu expresie pozitiva pentru proteina Top2A.

In tumorile pulmonare selectate (carcinoame microcelulare, scuamoase, nediferentiate cu celule mari si adenocarcinoame)  a fost determinata expresia unor factori de diferentire  neuroendocrina (CD56) si a unor factori  angiogenetici in corelatie cu expresia proteinei CD117 si a cerbB2. In cazuri selectate a fost determinata prin PCR,  prezenta unor mutatii ale genei c-kit la nivelul exonului 9 si 11 (P1).

Tumorile extraGIST selectate (P1,P5) dintr-o serie de tumori de tip stromal  pozitive sau negative pentru CD117, anticorp inclus intr-un panel complex de anticorpi (CD34, Actina, Proteina S-100, Nestina, Tau) au fost analizate prin PCR pentru mutatiile genei c-kit.

A fost de asemenea analizata o serie de cazuri de limfoame maligne nonHodgkin (LMNH) difuze cu celule mici  in vederea stabilirii  caracterelor morfologice si IHC asociate cu rezistenta la terapie. Au fost identificate si cazuri de LMNH anaplazice cu celule mari T sau B, CD 30 pozitive in vederea  stabilirii prezentei proteinei ALK (P6,P1).

A fost determinata expresia factorului nuclear NF-kB  si COX2 in tumori nazo-faringiene  in asociere cu prezenta unor componente proteice ale virusului Epstein-Barr (LMP) in paralel cu determinarea prin ISH a prezentei genomului viral, pentru evaluarea acestor biomarkeri cu valoare prognostica sau predictiva si  posibile implicatii in terapia specifica (P1).

A fost  continuata investigatia privind posibilitatea analizei proteomice in conditii normale si in tumori prin electroforeza bidimensionala. A fost efectuata verificarea parametrilor pentru electroforeza verticala in gel de poliacrilamida- SDS, aceasta fiind efectuata pe material proaspat si pe material inclus la parafina din limfoganglioni si LMNH cu celule mari anaplazice (P1).

A fost continuata analiza HP si IHC pentru determinarea micrometastazelor in ganglionii santinela  in cazuri selectate de tumori mamare, precum si in cazuri de tumori vezicale cu metastaze limfoganglionare (P3,P1).

A continuat procesul de monitorizare a cazurilor clinice in urmarire, cu tumori maligne diverse (mamare, vezicale, pulmonare, GIST etc.) (P7).

A fost determinata prin ISH  prezenta EBV pe tesut tumoral in carcinoame nazo-faringiene; a fost determinata prin PCR, prezenta mutatiilor genei c-kit, pe diferite tumori maligne selectate; au fost identificate prin FISH, cazuri cu amplificare genica pentru Her-2/neu si TOP-2A (P1). A fost optimizata metoda de determinare prin  PCR a unor mutatii ale genei BRCA1 pentru aplicarea in cazul unor paciente cu tumori mamare si antecedente familiale (P8).

 

Activitatile etapei a 4-a au inclus  completarea tabloului imunofenotipic tumoral cu testarea biomarkerilor cu semnificatie diagnostica si prognostica si cu date de genomica structurala privind gena BRCA1, furnizate de P8,  in tumori mamare selectate si stabilirea configuratiei IHC si a substratului molecular (ISH, FISH) a unor tumori mamare si vezicale selectate. Expresia proteica a genelor Her-2/neu si Top2A a fost analizata in tumori mamare (carcinoame ductale invazive) si tumori vezicale infiltrative cu sau fara metastaze limfoganglionare,  in corelatie cu expresia unor factori angiogenetici, in principal EGFR. Determinarea amplificarii genice prin FISH a fost realizata la tumori cu expresie pozitiva pentru proteina Top2A  si cerbB2.

In tumorile vezicale reprezentate de carcinoame uroteliale infiltrative cu sau fara metastaze limfoganglionare a fost determinat prin IHC si FISH statusul genelor Her-2/neu si Top2A, in vederea evaluarii corelatiilor cu pierderea heterozigozitatii (LOH) petnru pten, pe Cz 10q (P1).

In tumorile pulmonare selectate (carcinoame microcelulare), a fost determinata expresia unor factori de diferentire  neuroendocrina (CD56) si a unor factori  angiogenetici in corelatie cu expresia proteinei CD117 si in cazuri selectate a fost determinata prin PCR,  prezenta unor mutatii ale genei c-kit la nivelul exonului 9 si 11. Pozitivitatea IHC pentru proteina CD117 a fost apreciata dupa o analiza cu mai multi anticorpi monoclonali si seruri policlonale in vederea  eliminarii rezultatelor fals-pozitive sau fals-negative.

S-au analizat cazurile selectate in vederea optimizarii metodei de analiza prin microretele de cADN, pentru obtinerea unor informatii genetice suplimentare pentru monitorizarea ulterioara a modificarilor profilului genic al pacientelor  purtatoare de tumori mamare maligne.

Au fost utilizate metode de statistica descriptiva pentru analiza distributiei  datelor obtinute prin sistematizarea pozitivitatii biomarkerilor utilizati si a stabilirii corelatiilor intre acestia, cu semnificatie prognostica si predictiva (P1, terti).

 

Activitatile etapei a 5-a au inclus  selectarea electronica a unui numar mare de cazuri (7000) (P, terti), de tumori mamare  pozitive pentru ER, PGR, cerbB2 si TOP2A pentru alcatuirea modelului experimental de microretele virtuale, a unor cazuri de tumori mamare triplu negative, in special de la persoane tinere sau cu anumite particularitati evolutive, precum si selectarea de cazuri cu antecedente eredo-colaterale incarcate privind patologia tumorala si cu posibilitatea mostenirii  predispozitiei pentru tumori mamare; completarea tabloului imunofenotipic tumoral cu testarea biomarkerilor cu semnificatie diagnostica si prognostica  incluzand BRCA1si cu datele privind mutatii ale genei BRCA1 furnizate de P8, in tumori mamare selectate; stabilirea configuratiei  IHC a unor tumori mamare selectate; a fost executat un studiu experimental cu model virtual al profilului genic corespunzator anomaliilor expresiei proteice in tumori mamare prin intermediul scanarilor multiple si a unor microretele virtuale.

             In  tumori  epiteliale nediferentiate de naso-faringe a fost evaluata prezenta genomului EBV , comparativ cu limfoganglionii tributari acestor tumori, precum si cu limfoganglioni reactivi de la persoane cu patologie de tip  inflamator (P1).

             In limfoamele maligne nonHodgkin (LMnH) selectate a fost investigata prezenta unor factori ai cailor de activare  ale semnalelor; astfel au fost testate 6 cazuri de LMnH pentru NF-kB si s-a constatat  interventia markerului activat in toate aceste cazuri, care au avut si o evoluti clinica nefavorabila.

In tumorile pulmonare selectate (carcinoame nonmicrocelulare si adenocarcinoame), a fost determinata expresia PDGFRA si a unor factori de angiogeneza, in corelatie cu expresia proteinei CD117 si in cazuri selectate a fost determinata prin PCR,  prezenta unor mutatii ale genei c-kit la nivelul exonului 9 si 11 (P1).

In tumorile GIST s-au efectuat analize comparative intre cazurile pozitive si negative la CD117, cu evaluarea interventiei altor factori moleculari de tipul caveolinelor si a unor proteine particulare caracteristice  celulelor stem (Nestina)(P1).

 

Activitatile etapei a 6-a au constat in  furnizarea si sistematizarea datelor de IHC/proteomica si de genomica structurala de catre toti membrii consortiului (P1-P8), in vederea coroborarii cu datele de urmarire clinica, cu precizia diagnosticului, orientarea terapeutica si cu rezultatele terapeutice.  Coexpresia  imunofenotipica  a proteinelor unor gene cu valoare prognostica sau implicatii terapeutice (TOP2A, Her-2/neu, EGFR) a fost evaluata alaturi de studiul expresiei unor  biomarkeri (NF-kB, LMP/EBV, VEGF, VEGFR, CD117, CD56, NK1, CD34, Actina, Proteina S-100, Nestina, Tau etc.)  in caracterizarea diferentierii unor tumori si analiza unor noi categorii de proteine si gene implicate in transductia semnalelor, cu posibile aplicatii prognostice si terapeutice.  Datele privind expresiei oncoproteinei cerbB2 in tumori mamare si  vezicale  in corelatie cu expresia proteinei TOP2A si cu cea a unor factori angiogenetici (EGFR),  proteine  codificate  de gene implicate in mecanisme de transductie a semnalelor si  potentiale tinte terapeutice vor fi selectate in vederea  stabilirii unor corelatii  cu supravietuirea. Aceste corelatii vor fi analizate in primul rand pentru  loturile de tumori mamare (polichimiotratate, netratate, cu sau fara afectare limfoganglionara) care  au fost urmarite  de partenerul 3. Se va stabili ierarhia aplicarii testarii IHC pentru diferiti markeri, eliminandu-se aceia care sunt mai putin relevanti, ceea ce va determina posibile efecte economice privind aplicarea terapiilor  tintite.

Evidentierea  implicarii unor factori de transductie a semnaluilui ca NF-kB in tumori nazo-faringiene  a fost asociata  cu frecventa unor componente proteice ale virusului Epstein-Barr (LMP) si cu prezenta componentelor genomului viral determinate prin hibridizare in situ. S-a evaluat utilitatea analizei histopatologice si IHC a limfoganglionilor reactivi din vecinatatea tumorilor maligne de nazofaringe si cavum.

Au fost de asemenea evaluate aspectele histopatologice si IHC in unele limfoame maligne nonHodgkin difuze cu celule mici care ar putea fi implicate in rezistenta la terapie.

Tumorile pulmonare selectate au cuprins carcinoame nonmicrocelulare si microcelulare, precum si adenocarcinoame la care a fost determinata expresia unor factori angiogenetici in corelatie cu expresia proteinei cerbB2 si a CD117. Pentru acestea au fost determinate prin FISH sau PCR prezenta amplificarilor genice sau a unor mutatii de ex. ale genei c-kit (exon 9,11). 

Tumorile GIST si  extraGIST au fost selectate dintr-o serie de tumori mezenchimale CD117 pozitive, fiind analizate in paralel acestea (disgerminoame, seminoame, melanoame), prin intermediul unor noi paneluri (CD34, Actina, Proteina S-100, Nestina, Tau). A fost evaluata importanta aplicarii unor noi markeri de diagnostic in tumori GIST, (Nestina, Caveolina1), care ar putea fi exploatati ca tinte moleculare in terapia specifica. A fost confirmata de asemenea valoarea expresiei proteice a genei c-kit, precum si concordanta in unele cazuri cu prezenta mutatiilor pentru gena c-kit.

            Determinarea profilului genic prin cDNA microarray pentru tumori maligne selectate pe baza pattern-ului HP, a imunofenotipului si caracterelor moleculare a fost realizata experimental prin utilizarea unor modele de retele virtuale aplicabile pe un numar mare de cazuri  in vederea completarii pe baze statistice semnificative a caracterizarii tintelor moleculare ale terapiei individualizate. A fost evaluata selectarea   pe baza pattern-ului histopatologic si imunohistochimic a unui numar mare de cazuri consecutive pentru realizarea microretelelor virtuale si tumori mamare triplu negative  (ER, PGR, cerbB2); in tumori pozitive pentru ER, PGR, cerbB2, TOP2A  a fost executat un studiu experimental  al profilului expresiei proteice corespunzator unui profil genic virtual prin  intermediul microretelelor (matricei) matematice virtuale si a  scanarilor multiple; au fost determinate prin PCR multiplex  mutatii ale genei BRCA1  (P8), in tumori  de la paciente  cu antecedente eredo-colaterale incarcate in sensul predispozitiei ereditare posibile. S-a evaluat utilitatea completarii datelor clinice conform fisei oncologice (P3), cu analiza evolutiei unor cazuri cu anumite particularitati morfologice, IHC si moleculare.

            S-a realizat urmarirea clinica a unui lot de paciente de 208 cazuri (P4)  cu analiza perioadelor libere de boala si a supravietuirii in functie de parametri morfologici ca de ex. abundenta si dispozitia infiltratelor limfoide, de expresia imunohistochimica a limfangiogenezei si a statusului hormonal; analiza statistica multivariata (intercept) a aratat  ca un indicator important al prelungirii duratei de remisiune il constituie proportia de celule limfoide B in infiltratul limfoid precum si gradul de expresie a factorilor angiogenezei si limfangiogenezei.

             In limfoamele maligne nonHodgkin (LMnH) selectate a fost investigata prezenta unor factori ai cailor de activare  ale semnalelor; cazurile LMnH testate pentru NF-kB aratand interventia markerului activat, asociata cu o evoluti clinica nefavorabila,  mai ales in limfoamele anaplazice.

 

 

Rezultate obținute

Et.1.Au fost selectate din cazuistica proprie  a CO si P3,P4,P5,P6, P7, tumori mamare  de la paciente polichimiotratate,  in stadiul III sau IV de boala, dar si de la paciente netratate, sau fara metastaze (stadiu N0).

Au fost de asemenea selectate tumori vezicale superficiale la prima interventie sau recidivate  si tumori infiltrative; tumorile pulmonare selectate au cuprins carcinoame cu sau fara diferentiere neuroendocrina. Tumorile extraGIST au fost selectate dintr-o serie de tumori de tip stromal. Limfoamele cu celule mici au fost selectate pe baza evolutiei clinice, de la pacienti diagnosticati initial imunohistochimic cu LMNH cu celule mici si LMNH anaplazice (P6). Tumorile de cap-gat au inclus carcinoame de oro-faringe, laringe, nasofaringe.

Au fost sabilite primele paneluri de anticorpi pentru

-          tumori mamare (Top-2A, Her-2/neu, EGFR, VEGF, VEGFR);

-          tumori vezicale (Her-2/neu);

-          extraGIST (CD117);

-          carcinoame pulmonare (CD117),

-          LMNH (CD20/L26, CD45RO/UCHL1, CD30);

-          Carcinoame de cap-gat (COX2, VEGF, VEGFR).

Au  fost selectate tumori mamare si vezicale pentru efectuarea analizei moleculare pe care au fost efectuate testele de  hibridizare in situ pentru Her-2/neu si Top-2 A .

S-a reconsiderat analiza ARNm pentru tumorile extraGIST si carcinoamele pulmonare si aceasta a fost  efectuata prin RT-PCR in loc de ISH, asigurandu-se astfel o mai mare precizie a determinarii.

P2 si P8 au realizat documentarea pentru studiul GIST, respectiv genetica moleculara a tumorilor mamare,

Et.2. S-a realizat stabilirea unor configuratii ale imunoprofilurilor unor tumori mamare (P1,P4), vezicale, pulmonare, de cap-gat, tumori CD117 pozitive  (P1,P2) si a unor limfoame maligne nonHodgkin, si a stabilirii  diferentierii neuroendocrine in unele tumori maligne (P6). Au fost urmariti pacienti tratati cu diferite combinatii de chimioterapice si  anticorpi umanizati (P7). Au fost completate loturile de  cazuri pe criterii morfologice si IHC (P4,P6,P1,P3,P7). A fost determinata  prezenta secventelor EBV prin PCR  in carcinoame nazo-faringiene.

A fost optimizata extractia ARN din tesut la parafina in vederea efectuarii reactiei de RT-PCR pe cazuri selectate de tumori extraGIST si carcinoame pulmonare. A continuat procesul de monitorizare a cazurilor clinice in urmarire, cu tumori maligne diverse (mamare, vezicale, pulmonare etc.) (P7). A fost determinata prin PCR  prezenta EBV pe tesut tumoral in carcinoame nazo-faringiene (P1).

Et.3. Completarea unor configuratii ale imunoprofilurilor unor tumori mamare, vezicale, pulmonare, de cap-gat, tumori extraGIST CD117 pozitive si a unor limfoame maligne nonHodgkin, si a stabilirii  diferentierii neuroendocrine in unele tumori maligne pulmonare. Au fost urmariti pacienti tratati cu diferite combinatii de chimioterapice si  anticorpi umanizati. Au fost completate loturile de  cazuri pe criterii morfologice si IHC. A fost determinata  prezenta secventelor EBV prin ISH  in carcinoame nazo-faringiene, si a mutatiilor genei c-kit prin PCR in tumori extraGIST si tumori pulmonare (P1,P3-P8).

Et.4. S-a realizat completarea unor configuratii ale imunoprofilurilor unor tumori mamare, vezicale si  pulmonare. Au fost completate date de biologie moleculara pentru chimiopreventie si modularea terapiei specifice in unele tumori mamare. Au fost determinate mutatii aale genei c-kit prin PCR in tumori maligne pulmonare.  Au fost caracterizate din punct de vedere molecular, tumori maligne vezicale de tip infiltratic, cu si fara metastaze limfoganglionare, prin determinarea prin PCR a LOH pentru pten in Cz 10q (P1, P8).

Et.5. Rezultatele  obtinute  prin realizarea activitatilor si a obiectivului propus in aceasta etapa au constat in: completarea unui tablou genomic virtual determinat prin utilizarea unor modele virtuale de scanare multipla si a microretelelor virtuale, privind anumite tinte moleculare, in tumori maligne solide, in special de origine mamara; parametrii inclusi in aceste retele virtuale vor permite selectarea cazurilor in vederea realizarii microretelelor genomice in tumori mamare, ceea ce va permite aplicarea unor concepte matematice in diagnosticul histopatologic al unor tumori cu implicatii asupra prognosticului si terapiei tintite a pacientului. A fost efectuata  completarea unor configuratii ale imunoprofilurilor unor tumori mamare  triplu negative cu  determinarea BRCA1 si au fost realizate corelatii cu factori de angiogeneza (EGFR) si cu expresia unor proteine  ale unor oncogene (TOP2A). Au fost completate date de biologie moleculara privind biomarkerii pentru modularea terapiei specifice in unele tumori mamare si pulmonare. Afost analizata corelatia dintre diferiti biomarkeri ai unor tumori pulnomare altele decat cele cu celule mici (carcinoame epidermoide, adenocarcinoame), cu accent asupra prezentei PDGFRA, ca potentiala tinta terapeutica, la cazuri pozitive sau negative pentru CD117, imunohistochimic sau genetic. A fost determinata configuratia antigenica la tumori GIST pozitive sau negative pentru CD117, fiind testate noi antigene (Nestina, Caveolina 1) (P1,P3, P8, terti).

Et. 6. In aceasta etapa s-a realizat sinteza rezultatelor obtinute  in etapele anterioare. Astfel s-a definitivat alcatuirea unei  baze de date IHC/proteomica  si genomica  pentru un numar mare de cazuri de tumori mamare (7000), cu completarea unui tablou genomic virtual determinat prin utilizarea unor modele virtuale de scanare multipla si a microretelelor virtuale, privind anumite tinte moleculare. Astfel cazurile incluse in aceste retele virtuale vor permite selectarea mai precisa in vederea realizarii microretelelor genomice in tumori mamare, ceea ce va permite aplicarea unor concepte matematice in diagnosticul histopatologic al unor tumori cu implicatii asupra prognosticului si terapiei tintite a pacientului. Acest lucru se va reflecta in  cresterea eficientei economice a terapiei, cu evirtarea unor terapii costisitoare si inutile. Baza de date  cuprinde si un numar mare de tumori CD117 pozitive care pot fi permanent evaluate  in vederea unor terapii tintite (antitirozinkinazice). Completarea unor configuratii ale imunoprofilurilor unor tumori mamare  triplu negative cu  determinarea BRCA1 va permite furnizarea de indicatii asupra acelor cazuri care necesita o supraveghere clinica si imagistica mai stricta.  A  fost evaluata importanta corelatiei dintre diferiti biomarkeri in tumori pulnomare altele decat cele cu celule mici (carcinoame epidermoide, adenocarcinoame), cu accent asupra prezentei PDGFRA, ca potentiala tinta terapeutica, la cazuri pozitive sau negative pentru CD117, imunohistochimic sau genetic. Testarea de  noi antigene (Nestina, Caveolina 1) in tumori GIST pozitive sau negative pentru CD117 furnizeaza noi markeri de prognostic. (P1-P8, terti).

 

Stadiul realizării obiectivului planificat/forma de finalizare (a activității în cadrul fazei):

Obiectivul proiectului fost realizat in totalitate. Forma de finalizare a activitatilor in cadrul fazei este cea stabilita. In unele etape activitatile stabilite au fost realizate cu metode mai performante: PCR in loc de ISH pentru determinarea in GIST a genei c-kit, utilizarea microretelelor virtuale pentru  stabilirea unor profile genice pe un numar mare de cazuri de tumori mamare, verificate prin Real-time PCR (P8).

Evaluarea coexpresiei proteinelor unor oncogene cu valoare diagnostica  si prognostica (Her-2/neu, Top2a), poate stabili bazele unei terapii cu tinte unice sau multiple, cu posibilitatea unor evaluari statistic semnificative si cu potential  de aplicare clinica rapida, inscrise in cerintele cercetarii translationale. Determinarea unor noi markeri ca posibile tinte moleculare in terapia tumorilor pulmonare a relevat utilitatea unora dintre ele (CD117) in conditiile epidemiologiei tumorale caracteristice tarii noastre.

Corelarea aspectelor morfologice cu cele IHC  sau moleculare va permite cresterea preciziei diagnostice  si a valorii prognostice  si predictive a biomarkerilor analizati, precum  si caracterizarea unor noi tinte moleculare in scopul realizarii unei terapii antitumorale  individualizate

 

Diseminarea rezultatelor

            Lucrari publicate

1.   TOP2A –EGFR Correlations in triple - negative (TN) breast cancer  Carmen Ardeleanu1,2 , Mihaela Mihai1, Florina Vasilescu1, Cristina Iosif1, Dana Terzea1,2, Florin Andrei1, Alina Georgescu1, Camelia Dobrea1,2, Dorel Arsene1, Enache Simona1, Mihai Ceausu1,2, Ariana Visan1, Maria Comanescu1, Diana Ene1, Maria Neagu1, Georgeta Butur1, Florica Staniceanu2. 1“Victor Babes” National Institute of Pathology, Bucharest, Romania; 2 “Carol Davila” University of Medicine and Pharmacy, Bucharest, Romania. 3rd International Congresss of Pathology – Free Papers Book, Barcelona Spain, May 17-22,2008, Eds. Bombi JA, Ordi J, Ribalta T, Ramirez J. ISBN 978-88-7587-447-6

2.      ”Immunohistochemical expression in gastrointestinal stromal tumors (GISTs) end extragastrointestinal stromal tumors (EGISTs)

Simona Enache, Mihaela Mihai, Florina Vasilescu, Cristina Iosif, Florin Andrei, Dana Terzea, Mihai Ceaușu, Alina Georgescu,  Camelia Dobrea, Dorel Arsene, Valentin Enache, Georgeta Butur, Maria Neagu, Diana Teletin, Carmen Ardeleanu:, 3rd Intercontinental Congress of Pathology, Barcelona, 17-22 may 2008. – Free Papers Book, Barcelona Spain, May 17-22,2008, Eds. Bombi JA, Ordi J, Ribalta T, Ramirez J. ISBN 978-88-7587-447-6

 

            Comunicari la manifestari stiintifice nationale  si internationale

1. The 3rd International Congress for Medical Students and Young Doctors, Iași, 16th-19th of March 2006.

“Immunohistochemical expression and in situ hybridization for Epstein-Barr virus (EBV) detection in nasopharyngeal carcinoma“,

Georgescu Alina G.M., Vișan Ariana, Murariu Andrei, Hurduc Dan, Bobocea Cristian, Ardeleanu Carmen, Ceaușu Mihai. Vol. rez. pg.37, ISBN 978-973-87769-5

2.  2nd Intercongress of European Society of Pathology, 25-27 May  2006, Ioanina, Greece.

Molecular detection of Epstein-Barr virus (EBV) in nasopharygeal carcinoma

Ceausu Mihai, Iosif Cristina, Butur Georgeta, Georgescu Alina G.M., Florea Gramada Zenaida, Ardeleanu Carmen:, 2nd Intercongress of -1European Society of Pathology, May, Ioanina Greece, Virchows Archiv, May 2006, vol.448, nr.5, pg.683, P048 ISSN 0945-6317.

3.      Al 3-lea Simpozion Național de Patologie, Sesiunea anuală a Institutului Național „Victor Babeș” cu participare internațională, Bucuresti 1-3 Noiembrie 2006

     „Ținte terapeutice în carcinoamele pulmonare” Florina Vasilescu, Cristina Iosif, Mihaela Mihai, Dana    Terzea, Camelia Dobrea, Alina Nicolae, Fl. Andrei, Alina Georgescu, M. Ceaușu, Alina Anghel, Elena Ion, Fl. Hălălău:, Al 3-lea Simpozion Național de Patologie, Sesiunea anuală a Institutului Național „Victor Babeș” cu participare internațională, vol. rez. pg. 23, ISBN[10]: 973-708-005-x ISBN[13]: 978-973-708-005-9, București, 1-3 noiembrie 2006

4.      Al 3-lea Simpozion Național de Patologie, Sesiunea anuală a Institutului Național „Victor Babeș” cu participare internațională, Bucuresti 1-3 Noiembrie 2006

     Tumora gastrica stromala cu diferentiere mixta – prezentare de caz,

     Eliza Gramada, Geanina Micu, Alina Georgescu, Dragos Simeanu, Adina Ene, Sabina Zurac, Carmen Ardeleanu, Florica Staniceanu: vol. rez. pg. 88, ISBN[10]: 973-708-005-x ISBN[13]: 978-973-708-005-9, București, 1-3 noiembrie 2006

5.      Al 3-lea Simpozion Național de Patologie, Sesiunea anuală a Institutului Național „Victor Babeș” cu participare internațională, Bucuresti 1-3 Noiembrie 2006

„Corelații morfo-imunohistochimice în tumori stromale gastro-intestinale”,

Mihaela Mihai, Simona Florescu, Mihai Ceaușu, Cristina Iosif, Alina G.-M. Georgescu, Florina Vasilescu, Florin Andrei, Dana Terzea, Ariana Vișan, Zenaida Ceaușu, Diana Ene, Maria Neagu, Valentina Muntean, Alina Anghel, Tatiana Petre, Elena Ion, Georgeta Butur, Carmen Ardeleanu, Cristescu Teodora Pia: Al 3-lea Simpozion Național de Patologie, Sesiunea anuală a Institutului Național „Victor Babeș” cu participare internațională, vol. rez. pg. 88, ISBN[10]: 973-708-005-x ISBN[13]: 978-973-708-005-9, București, 1-3 noiembrie 2006

6.  Conferinta internationala „New Perspectives in Cancer Pathology” de la Bucuresti in Mai 2007: . „Prognostic and predictive factors associated with Top II alpha expression in breast cancer”

Ardeleanu C, Andrei F, Vasilescu Fl, Iosif C Terzea, D, Mihai M,   Ceausu M, Georgescu A, Butur G,  Neagu M, Ene D.“Victor Babes” National Institute of Pathology , Bucharest

7.   Adriatic Society of Pathology 22nd International Meeting 22nd-24th of June 2007, Grottammare, Italia:

“The immunohistochemical and molecular status of Epstein-Barr virus (EBV) in lymphnodes draining  nasopharyngeal carcinoma”,

Cristina Iosif, Liliana Popescu, Alina Georgescu, Florina Vasilescu, Dana Terzea, Mihaela Mihai, Florin                     Andrei, Mihai Ceaușu, Dorel Arsene, Maria Neagu, Diana Ene, Georgeta Butur, Carmen Ardeleanu:  vol. rez. pg. 30, Grottammare, Italia, 22-24 iunie 2007. Lucrare premiata

8.      Simpozionul National de Cercetare Stiintifica Medicala de Excelenta, CEEX, 2007, Sibiu, Septemebrie 2007, 

 Receptori tirozin-kinazici in carcinoamele uroteliale infiltrative.

Ardeleanu C, Gluck G, Mihai M, Vasilescu Fl, Andrei Fl, Terzea D, Iosif C, Dobrea C, Arsene D, Neagu M, Ene D, Enache S, Georgescu A, Visan A, Butur G,  vol. rez. pg. 85, ISBN: 978-973-708-272-5, Sibiu, România, 25-26 octombrie 2007

9.      21st  European Congress of Pathology, Sept 08-13, 2007, Istanbul, Turkey:

       Hemorrhagic GIST with neural differentiation in an inflammed Meckel diverticulum – case report. Ceausu M, Ichim P, Ceausu M, Andrei F, Ceausu Z, Ene D, Florescu S: Virchows Archiv, 451, 2, abstr. PP1-93, p.222. ISSN 0945-6317

10.  33rd FEBS Congress 11th IUBMB Conference, June 28-July 3 2008 Atena, Grecia

   Comparison  of Immunohistochemical and fluorescence in situ hybridization assessment for Topoisomerase  II alpha gene and Her-2/neu status in breast carcinoma      

Neagu M, Andrei F, Butur G, Teletin D, Georgescu A,  Ardeleanu C.. The FEBS Journal 275 (Suppl1), abstr PP7C-52, pag. 340.

11.  3rd Intercontinental Congress of Pathology, May 17-22, 2008, Barcelona Spania: Systemic  anaplastic large cell lymphoma- a multicentric clinico-pathological study. Dobrea C, Colita D, Lupu A, Vladareanu A-M, Arion C, Ardeleanu C, Nicolae A, Iosif C,  Vasilescu F, Terzea D,  Mihai M, Andrei Fl, Colita A, Caban L, Moicean A-D,  Coriu D, Stoia R, Niculescu-Mizil E, Georgescu O. Abstr. P-43

12.   Simpozionul National VIASAN-CEEX, Sinaia, 28-30 Sept.  2008: Tinte moleculare protein-kinazice in tumorile stromale gastrointestinale (GIST). Autori: S. Enache, M.Mihai, Fl. Vasilescu, C.Iosif, Fl.Andrei, D Terzea, M Ceausu, D Arsene, A Georgescu, C Dobrea, V Enache, G Butur, M Neagu, D Teletin, C Ardeleanu

13.  Simpozionul National VIASAN-CEEX, Sinaia, 28-30 Sept.  2008 Evaluarea prin imunohistochimie si hibridizare in situ a statusului genei Her-2/neu si TOP2A in cancerul de san. Neagu M, Andrei Fl, Butur G, Teletin D, Georgescu A, Ardeleanu C. Lucrare premiata

14.   XXVII-th International Congress of the International  Academy of Pathology Atena, 12-17 Octombrie, 2008: „Immunohistochemical coexpression of BRCA1 and TOP2A  in triple negative breast cancer”. Comanescu M, Ardeleanu C, Vasilescu F, Terzea D, Mihai M, Iosif C, Georgescu A, Andrei F, Dobrea C, Ene D, Neagu M, Ceausu M, Cionca F, Balan A, Staniceanu F. Virchows Arch, 452, May 2008 Abstr. 072

15.  XXVII-th International Congress of the International  Academy of Pathology Atena, 12-17 Octombrie, 2008:

      Immunohistochemical assessment of Caveolin-1 and Nestin in GISTs .

Enache S,  Ceausu M, Mihai M, Vasilescu F, Andrei F, Terzea D, Arsene D, Butur G, Teletin D, Manole C, Popescu LM, Ardeleanu C. Virchows Arch, 452, May 2008, Abstr. 301.

Workshop –ul „Tinte moleculare  in diagnosticul si terapia tumorilor maligne” in cadrul  celui de-al 5-lea Simpozion National de Ptaologie cu participare internationala si a Sesiunii anuale a Institutului  „Victor Babes” , Bucuresti 4-6 Noiembrie, 2008.Vol. rez. P 40-41, ISBN 978-973-708-355-5

 

            Brevete