PN 23.16.01.02

Activități și progresul proiectului

2023 – Faza 1

Evaluarea cooperării inter-tisulare prin molecule solubile pe modele experimentale in-vitro

În prima etapă a proiectului au fost dezvoltate și optimizate modelele experimentale in-vitro necesare investigării comunicării dintre celulele musculare și neuronii dopaminergici.

Activitățile au inclus optimizarea condițiilor de cultivare și diferențiere a celulelor musculare umane și validarea procesului de diferențiere prin metode morfologice și moleculare.

A fost dezvoltat și caracterizat un sistem de co-cultură între celule musculare diferențiate și neuroni dopaminergici, în condiții experimentale care permit compararea interacțiunilor celulare în prezența sau absența unor modificări asociate fenotipului de boală Parkinson.

În cadrul acestor sisteme experimentale au fost analizate profilurile unor miokine implicate în comunicarea intercelulară, atât la nivel celular, cât și în mediul de cultură. Analizele au fost realizate prin tehnici complementare, incluzând multiplexarea proteinelor și Western blot.

În paralel, au fost investigate profilurile de expresie ale miRNA-urilor și au fost selectați candidați pentru analizele ulterioare.

Au fost, de asemenea, optimizate metode pentru evaluarea unor markeri epigenetici, inclusiv analiza gradului de metilare a ADN-ului genomic.

Activitățile acestei faze au permis stabilirea platformei experimentale in-vitro necesare investigării dialogului molecular dintre țesutul muscular și cel nervos.

2024 – Faza 2

Obținerea și caracterizarea modelului experimental in vivo studies de boală Parkinson

În cea de-a doua etapă, cercetările au fost extinse de la sistemele celulare la modele experimentale in vivo studies.

Au fost evaluate modele animale de boală Parkinson și au fost stabilite loturile experimentale necesare studierii modificărilor musculare și neurologice asociate bolii.

O componentă importantă a fazei a fost evaluarea efectului exercițiului fizic moderat. Au fost dezvoltate și testate protocoale de antrenament pe roată pentru rozătoare, în vederea investigării influenței activității fizice asupra țesutului muscular și asupra parametrilor moleculari urmăriți în cadrul proiectului.

Au fost recoltate și procesate probe de mușchi scheletic, creier și sânge, necesare analizelor histologice, moleculare și biochimice.

Țesutul muscular a fost caracterizat prin metode histologice, histochimice și morfometrice, fiind urmărite organizarea țesutului, caracteristicile diferitelor tipuri de fibre musculare și parametri asociați funcției mitocondriale.

În paralel, au fost optimizate metodele necesare investigării unui panel de miokine cu rol în funcția și metabolismul muscular, răspunsul la exercițiu și comunicarea cu sistemul nervos central.

Această etapă a permis consolidarea modelului experimental in vivo studies și constituirea loturilor și a colecției de probe biologice necesare etapei următoare a proiectului.

2025 – Faza 3

Investigarea biomarkerilor implicați în comunicarea pe axa creier–mușchi

În această etapă, cercetările s-au concentrat asupra caracterizării biomarkerilor implicați în comunicarea dintre mușchiul scheletic și sistemul nervos central în modelul experimental de boală Parkinson.

Au fost completate loturile experimentale și au fost analizate animale în funcție de mai mulți parametri biologici și experimentali, incluzând genotipul, vârsta, sexul și efectuarea antrenamentului fizic.

De la animalele incluse în studiu au fost recoltate probe de mușchi scheletic, creier și plasmă, care au permis investigarea comparativă a acelorași mecanisme moleculare în compartimente biologice diferite.

Analiza miokinelor

A fost investigat un panel de miokine cu rol în homeostazia musculară, metabolism, inflamație, regenerare și răspunsul la exercițiu fizic.

Expresia acestora a fost evaluată în probe tisulare de mușchi și creier și în probe biologice circulante, în vederea caracterizării relației dintre compartimentul periferic și sistemul nervos central.

Au fost comparate loturi cu și fără modificări asociate bolii Parkinson și loturi cu și fără exercițiu fizic, pentru evaluarea influenței acestor factori asupra profilurilor moleculare investigate.

Analiza miRNA

În paralel cu analiza miokinelor, au fost investigate miRNA-uri selectate pe baza relevanței lor pentru mecanismele studiate în cadrul proiectului.

Au fost optimizate și aplicate metode de analiză a miRNA-urilor în probe tisulare și circulante, în vederea integrării acestor date cu profilurile de expresie ale miokinelor.

Analiza markerilor epigenetici

Au fost continuate investigațiile privind mecanismele epigenetice asociate modificărilor musculare și neurologice.

Analizele au inclus evaluarea gradului de metilare a ADN-ului genomic și investigarea unor mecanisme moleculare implicate în reglarea epigenetică și răspunsul celular la stres.

2026 – Faza 4

Validarea clinică a biomarkerilor implicați în comunicarea pe axa mușchi–creier în boala Parkinson

În etapa actuala, cercetările vor fi extinse către validarea clinică a biomarkerilor identificați și selectați în etapele experimentale anterioare ale proiectului.

Studiul va urmări evaluarea unui panel țintit de biomarkeri circulanți la pacienți cu boala Parkinson și la persoane control, în vederea investigării asocierii acestora cu severitatea bolii și cu afectarea funcției musculare.

Vor fi analizate comparativ grupuri de pacienți aflați în diferite stadii ale bolii Parkinson. Datele moleculare vor fi corelate cu parametri clinici relevanți pentru severitatea bolii, funcția motorie și funcția musculară.

O componentă a studiului va urmări integrarea profilului miokinelor circulante cu analiza unor miRNA-uri selectate, în vederea evaluării unei semnături moleculare asociate axei mușchi–creier.

Această etapă urmărește translația rezultatelor obținute pe modelele experimentale in-vitro and in vivo studies către patologia umană și evaluarea potențialului biomarkerilor studiați pentru stratificarea pacienților și pentru dezvoltarea ulterioară a unor instrumente cu valoare prognostică.

Stadiu: etapă de validare clinică în curs.

Integrarea datelor

Datele moleculare obținute din plasmă, mușchi și creier sunt analizate comparativ pentru caracterizarea comunicării pe axa creier–mușchi și pentru identificarea unor biomarkeri candidați cu relevanță pentru progresia bolii și afectarea musculară asociată.

Analiza integrată urmărește, de asemenea, evaluarea influenței exercițiului fizic asupra mecanismelor moleculare studiate.

Metode utilizate

Pentru realizarea obiectivelor proiectului sunt utilizate metode complementare de biologie celulară și moleculară, histologie și analiză proteică, printre care:

• culturi celulare și sisteme de co-cultură neuron–mușchi;
• imunofluorescență și microscopie;
• Western blot;
• multiplexare Luminex xMAP;
• RT-PCR și qRT-PCR;
• ddPCR;
• analiza miRNA;
• analiza metilării ADN;
• histologie și histochimie musculară;
• analiză morfometrică;
• metode de analiză statistică și integrare a datelor.

Relevanța proiectului

Studierea integrată a mușchiului scheletic, sistemului nervos central și biomarkerilor circulanți contribuie la o mai bună înțelegere a mecanismelor implicate în interacțiunea dintre afectarea musculară și neurodegenerare.

Abordarea utilizată în proiect permite investigarea axei creier–mușchi din perspectiva comunicării moleculare inter-tisulare și evaluarea modului în care aceasta poate fi influențată de progresia bolii și de activitatea fizică.

Rezultatele obținute în cadrul proiectului sunt în curs de analiză, valorificare și diseminare prin publicații și manifestări științifice de specialitate.

Rezultate estimate ale proiectului

• modele experimentale proof-of-concept in vitro and in vivo studies pentru studierea comunicării pe axa creier–mușchi;
• caracterizarea unor molecule implicate în comunicarea dintre țesutul muscular și sistemul nervos central;
• identificarea unor profiluri de miokine și miRNA cu potențială relevanță pentru progresia bolilor neurodegenerative;
• caracterizarea unor mecanisme epigenetice asociate proceselor investigate;
• selectarea unor biomarkeri candidați pentru studii ulterioare de validare.