Proiecte in derulare Genetica

COFUND-ERANET E-RARE 3-HETER-OMICS-2, 88/2019

Abordarea multi-OMICS a malformatiilor corticale cerebrale

Valoarea totală a contractului: 585.063,00 lei reprezentând 125.550,00 euro

Perioada de desfasurare: 01/06/2019-31/05/2022

Echipa: Aurora Arghir, PhD; Sorina Mihaela Papuc, PhD; Maria Dobre, PhD; Alina Erbescu

 

Rezumat

Heterotopia reprezinta o pozitionare anormala a neuronilor in cortexul cerebral. Heterotopiile sunt boli rare de neurodezvoltare care duc la forme severe de epilepsie si dizabilitate intelectuala. Aceste tulburari formeaza un spectru ce variaza de la grupari neuronale anormale la nivelul ventriculilor cerebrali (periventricular) la heterotopii localizate in substanta alba (subcortical). Pentru a investiga caile specifice, convergente care stau la baza acestor tulburari este foarte importanta intelegerea tipurilor de celule care functioneaza anormal si traiectoriile lor de dezvoltare anormala, precum si caracterizarea consecintelor functionale ale acestora. In plus, acumularea de date clinice si moleculare de la pacienti neinvestigati anterior ofera o perspectiva clinica importanta. Scopul acestui proiect este acela de a caracteriza genetic o cohorta de copii cu heterotopie si de a corela datele genetice cu cele clinice. Acest proiect, prin integrarea multi-dimensionala a datelor, va permite identificarea de noi variante / gene candidate si potentiale surse terapeutice. In plus, familiile acestor pacienti vor beneficia de posibilitatea unei mai bune caracterizari clinico-genetice.

Obiectiv

Caracterizarea genetica comprehensiva a unei noi cohorte de pacienti cu heterotopii si corelarea cu datele clinice si imagistice

Etapa 1
Dec 2019

Malformatiile de dezvoltare corticala cerebrala (MDC) sunt o cauza importanta de epilepsie si intarziere in dezvoltare. Dintre MCD, heterotopiile sunt afectiuni heterogene din punct de vedere genetic, cu o gama larga de defecte raportate, de la microdeletiii si microduplicatii la mutatii punctiforme ceea ce impune utilizarea unui panel de tehnici de investigatie genetica care sa detecteze atat anomaliile cantitative genomice cat si pe cele de secventa.

Obiectivele etapei 1

– Initierea grupului de studiu si a colectiei de probe biologice primare si procesate obtinute de la pacientii cu heterotopie

– Optimizarea protocoalelor experimentale de screening mutational tintit prin secventiere clasica

– Stabilirea protocolului de investigatie genomica prin microarray cromozomial

Metodologiile utilizate si rezultatele obtinute

In etapa actuala au fost efectuate activitati de initiere a bazei de date si colectiei de probe biologice, precum si de configurare si optimizare a testelor moleculare, bazate pe secventiere si microarray. Au fost inclusi in studiu pacienti cu diferite forme de heterotopie, fiind disponibile probe biologice de la probanzi si parintii acestora. Au fost efectuate activitati de procesare preliminara a probelor biologice si izolare ADN. A fost optimizata metoda de secventiere directa pentru analiza de secventa a genelor FLNA si DCX utilizand sistemul pentru electroforeza capilara Applied Biosystems ABI 3500 Genetic Analyzer fiind stabilit protocolul de lucru pentru etapele ulterioare. A fost initiat screening-ul genomic pentru anomalii ale numarului de copii ADN prin hibridizare comparativa genomica bazata pe microarray (array-CGH), efectuata pe platforma Agilent SureScan. Au fost obtinute primele profile genomice cu lame microarray oligonucleotidice de inalta densitate, OGT 4x180K si au fost analizate dezechilibrele genomice.

Concluzii

In aceasta etapa au fost atinse in totalitate obiectivele de etapa propuse.

– A fost initiata baza de date de pacienti cu heterotopii si au fost inregistrate date de la pacientii inclusi pana la data raportarii.

– Au fost stabilite proceduri uniforme de procesare si extractie ADN din probele biologice prelevate si a fost initiata colectia de acizi nucleici din cadrul proiectului.

– Au fost efectuate activitati de optimizare a tehnicii de secventiere Sanger pentru genele FLNA si DCX utilizand ADN control fara modificari la nivelul genelor testate, stabilindu-se protocolul de lucru.

– A fost stabilit protocolul de lucru si a fost initiat screening-ul genomic bazat pe array-CGH.

– Au fost efectuate comunicari stiintifice sub forma a doua postere si o comunicare orala la diferite manifestari stiintifice din domeniul geneticii si neuropsihiatriei (A XI-a Conferinta de Genetica Medicala cu Participare Internationala, Timisoara si A XXVII-a Conferinta Nationala a Asociatiei Romane de Lupta Impotriva Epilepsiei, Bucuresti).

Etapa 2
Dec 2020

Malformatiile de dezvoltare corticala cerebrala (MDC) sunt o cauza importanta de epilepsie si intarziere in dezvoltare. Dintre MCD, heterotopiile sunt afectiuni heterogene din punct de vedere genetic, cu o gama larga de defecte raportate, de la (micro)deletiii si (micro)duplicatii la anomalii de secventa, ceea ce impune utilizarea unui panel de tehnici de investigatie genetica care sa detecteze atat dezechilibrele genomice cat si variatiile de secventa.

 

Obiectivele etapei 2

– Completarea colectiei de probe biologice

– Screening mutational prin secventierea clasica a genei FLNA

– Screening-ului genomic pentru anomalii ale numarului de copii ADN, bazat pe array CGH

– Optimizarea protocoalelor experimentale de screening mutational prin secventiere de noua generatie a intregului exom

– Diseminarea rezultatelor obtinute

Metodologiile utilizate si rezultatele obtinute

In etapa actuala au fost efectuate activitati de caracterizare genetica a pacientilor inclusi in studiu si de optimizare a unor teste moleculare, bazate pe secventiere de noua generatie a intregului exom.

Au fost continuate activitatile de completare a bazei de date si colectiei de probe biologice prin receptionarea si procesarea probelor biologice de la 10 pacienti cu heterotopii si parintii acestora.

Au fost realizate experimente de microarray cromozomial (lame 4x180k, OGT Constitutional v3) pentru 12 pacienti si au fost identificate un CNV patologic si trei CNV-uri de semnificatie incerta. Screening-ul mutational al genei FLNA a fost realizat prin secventiere clasica Sanger la 3 pacienti, fara a fi detectate variante de secventa patologice sau de semnificatie incerta in ampliconii analizati.

A fost adaptat si optimizat protocolul de lucru pentru secventierea intregului exom, utilizandu-se o metoda de obtinere a librariilor bazata pe PCR, cu kitul AmpliSeq for Illumina Exome Panel. Aceasta metoda permite obtinerea unei acoperiri uniforme inalte si specifice (>90%) cu obtinerea unui volum mare de date (aprox. 59 MB). Pregatirea bibliotecilor pentru secventiere s-a realizat pentru 8 probe biologice provenite de la 3 pacienti si parintii acestora.

Activitatile de diseminare au fost realizate prin participarea la Conferinta Europeana de Genetica Umana cu o lucrare sub forma de poster ( „ Brain malformations diagnosis and clinical management in pediatric patients”) si trimiterea spre publicare la revista Experimental and Therapeutical Medicine a unui manuscris “Clinical and genomic findings in brain heterotopia – report of a pediatric patient cohort from Romania” aflat in prezent in etapa de evaluare, cu decizia de revizie minora.

In plus, in 28-29 ianuarie 2020 a avut loc la Paris intalnirea de lucru a consortiului HETEROMICS, coordonat de Prof Fiona Francis. Institutiile si grupurile de cercetare implicate in consortiu au prezentat materiale de descriere a echipei si temelor de cercetare abordate in general precum si de descriere a activitatilor derulate in prima etapa a proiectului si a gradului de realizare a obiectivelor de faza.

Concluzii

– In aceasta etapa au fost atinse in totalitate obiectivele de etapa propuse.

– A fost completat grupul de studiu si colectia de probe biologice;

– A fost realizat screening-ul mutational prin secventierea clasica a genei FLNA la pacientii cu date clinico-imagistice sugestive si a fost realizata analiza datelor si interpretarea semnificatiei variantelor de secventa detectate;

– A fost realizat screening-ul genomic prin array CGH pentru toti pacientii grupului 1 de studiu si suplimentar pentru 4 pacienti din grupul 2. A fost realizata analiza profilelor genomice si au fost clasificate CNV-urile, pe baza semnificatiei clinice;

– A fost optimizat protocolul experimental de secventiere de noua generatie a intregului exom si au fost secventiate 8 probe biologice;

– Rezultatele activitatilor desfasurate in cadrul proiectului au fost diseminate la evenimente stiintifice si trimise pentru publicare la reviste de profil.

Etapa 3
Dec 2021

Malformatiile congenitale, intarzierea de dezvoltare si dizabilitatea intelectuala sunt cele mai frecvente probleme medicale in populatia pediatrica si reprezinta un grup heterogen de boli cu un impact semnificativ asupra calitatii vietii. Malformatiile cerebrale corticale (MCD) au frecvent o cauza genetica, progresul tehnologiilor de investigare aducand permanent informatii noi privind arhitectura genetica a acestor afectiuni. Caracterizarea defectelor genetice in MCD contribuie la descifrarea cailor de patogeneza si au potentialul de a identifica tinte moleculare pentru terapii personalizate. Totodata, elucidarea etiologiei genetice poate contribui la optimizarea managementul clinic si terapeutic, la evaluarea prognosticului si a evolutiei bolii.

Obiectivele etapei 3

  • Extinderea colectiei de probe biologice;
  • Screening mutational prin secventierea clasica a genelor FLNA si DCX la pacientii cu profil clinic si imagistic sugestiv pentru defecte ale acestor gene;
  • Screening-ului genomic pentru anomalii ale numarului de copii ADN, bazat pe array CGH;
  • Screening mutational prin secventiere de noua generatie a intregului exom (Whole Exome Sequencing – WES) la pacienti selectati pe baza fenotipului clinic si imagistic, fara alte modificari genetice relevante pentru malformatia cerebrala;
  • Analiza si interpretarea datelor obtinute;
  • Diseminarea rezultatelor obtinute.

Metodologiile utilizate si rezultatele obtinute

In etapa actuala au fost efectuate activitati de caracterizare genetica a pacientilor inclusi in studiu, inclusiv investigatii bazate pe secventiere de noua generatie a intregului exom, la pacienti selectati. Au fost continuate activitatile de completare a bazei de date si a colectiei de probe biologice. In aceasta etapa au fost primite probe biologice de la 10 pacienti cu heterotopii si parintii acestora.

Profilul genomic a fost caracterizat prin studii de microarray cromozomial pentru 12 probe biologice, utilizand lame microarray 4x180K (OGT Constitutional v3 cu design specific pentru bolile genetice de dezvoltare). Screening-ul genomic prin array CGH a fost finalizat pentru toti pacientii, cu identificarea, in aceasta etapa a unor variante cu semnificatie incerta.  

Au fost investigati prin secventiere clasica Sanger toti pacientii cu fenotipuri sugestive pentru testare genetica tintita: trei pacienti utilizand primeri pentru regiunile codificatoare ale genei FLNA si doi pacienti utilizand primeri pentru exonii genei DCX. Nu au fost detectate variante de secventa patologice sau de semnificatie incerta in gena FLNA. A fost detectata o varianta patologica in gena DCX, in asociere cu heterotopia subcorticala in banda la o pacienta de sex feminin si fenotip caracteristic pentru afectarea functiei genei DCX.

Protocolul de pregatire a bibliotecilor pentru secventiere a fost realizat pentru 8 probe biologice selectate. Bibliotecile obtinute au fost denaturate si secventiate pe platforma NextSeq 550 (Ilumina) cu kit-ul NextSeq 500/550 cu 300 de cicluri (acces si suport logistic asigurat de membrii echipei CRGM Dolj din cadrul SCJU Craiova si UMF Craiova). Datele au fost analizate si interpretate utilizand programe dedicate, in etape succesive pe doua module, de analiza individuala (caz unic) si analiza comparativa (analiza trio). O atentie deosebita a fost acordata genelor cunoscute a fi implicate in aparitia malformatiilor cerebrale, ulterior realizandu-se etapa de interogare a intregului exom pentru potentiale gene candidat.

Activitatile de diseminare au fost realizate prin comunicarea cate unei lucrari  la Conferinta Europeana de Citogenomica, Conferinta Excellence in Pediatrics, Congresul European de Psihiatrie, Congresul National de Pediatrie, si Conferinta Societatii Romane Impotriva Epilepsiei. A fost publicat in revista Experimental and Therapeutic Medicine un articol stiintific original cu titlul “Clinical and genomic findings in brain heterotopia – report of a pediatric patient cohort from Romania”, (1 decembrie 2021, https://doi.org/10.3892/etm.2021.11024). In plus, a fost depus pentru evaluare la revista Revista Romana de Medicina de Laborator, indexata in Web of Science (factor de impact 1,027), un manuscris cu rezultate originale intitulat „Novel DCX pathogenic variant in a girl with subcortical band heterotopia”. In primul semestru al anului 2022, articolul a fost acceptat pentru publicare.

In perioada 13-14 ianuarie 2021 a avut loc la intalnirea de lucru virtuala a consortiului HETEROMICS, coordonat de Prof Fiona Francis, Universitatea Sorbona, Paris. Institutiile si grupurile de cercetare implicate in consortiu au prezentat rezultatele intermediare obtinute in a doua etapa a proiectului si gradul de realizare a obiectivelor de faza.

In concluzie, in etapa a doua au fost atinse toate obiectivele de etapa propuse:

  • A fost completata colectia de probe biologice;
  • A fost realizat screening-ul mutational prin secventierea clasica a genei FLNA si DCX la toti pacientii cu date clinico-imagistice sugestive pentru investigarea tintita a acestor gene si a fost realizata analiza datelor si interpretarea semnificatiei variantelor de secventa detectate;
  • A fost finalizat screening-ul genomic prin array CGH pentru toti pacientii, analiza profilelor genomice si clasificarea CNV-urilor, in conformitate cu contributia potentiala la patogeneza;
  • A fost efectuat protocolul experimental de secventiere de noua generatie a intregului exom pe probe selectate si datele obtinute au fost analizate si interpretate;
  • Au fost comunicate lucrari stiintifice la trei conferinte europene si doua conferinte nationale; a fost publicat un articol original si a fost trimis pentru evaluare un manuscris cu rezultate originale, la o revista indexata in Web of Science, acceptat pentru publicare in cursul primului semestru al anului 2022.

Etapa 4
Dec 2022

Obiectivele etapei 4

  • Evaluarea datelor genetice preliminare precum si a celor clinice si imagistice, in colaborare cu partenerul 5 din cadrul consortiului, in vederea aplicarii secventierii intregului exom – WES
  • Screening mutational prin secventiere de noua generatie a intregului exom a pacientilor selectati si a parintilor acestora (open-exome)
  • Analiza datelor si interpretarea rezultatelor generate in perspectiva detectiei de noi variante in gene cunoscute sau gene candidat cu potential de a constitui tinte terapeutice
  • Diseminarea rezultatelor prin comunicarea de lucrari la conferinte nationale si internationale, publicarea de articole stiintifice

Metodologiile utilizate si rezultatele obtinute

In etapa actuala au fost efectuate investigatii bazate pe secventiere de noua generatie a intregului exom pentru cinci pacienti si parintii acestora. A fost astfel completat grupul propus de 12 investigatii  WES in trio (pacient si ambii parinti).

Probele biologice au fost reprezentate de sange periferic, recoltate de la pacienti si parintii acestora. Protocolul de pregatire a bibliotecilor pentru secventiere s-a realizat pentru 16 probe biologice selectate. Bibliotecile obtinute au fost denaturate si secventiate pe platforma NextSeq 550 (Illumina) cu kit-ul NextSeq 500/550 cu 300 de cicluri. Datele au fost analizate si interpretate utilizand programul NextGene (SoftGenetics), in etape succesive. A fost utilizat modulul creat in faza anterioara pentru analiza individuala (caz unic) si modulul de analiza comparativa (analiza trio). O atentie deosebita a fost acordata, in prima etapa de analiza, genelor cunoscute a fi implicate in aparitia malformatiilor cerebrale. Ulterior au fost analizate celelalte gene ce codifica proteine. Evaluarea semnificatiei clinice a variantelor detectate a fost realizata prin interogarea bazelor de date populationale (de exemplu GnomAD) si a celor cu variante raportate la pacienti cu patologii de neurodezvoltare (ClinVar, Decipher, OMIM).

Activitatile de diseminare au fost realizate prin comunicarea a cate unei lucrari la patru conferinte internationale (Conferinta Europeana de Genetica Umana, Congresul Societatii Europene de Neurologie Pediatrica, Congresul International de Neurologie Pediatrica si Conferinta Excelenta in Pediatrie) si la Congresul Societatii Romane de Genetica Medicala. A fost publicat in Revista Romana de Medicina de Laborator (factor impact 1,027) articolul stiintific original “Novel DCX pathogenic variant in a girl with subcortical band heterotopia” (DOI:10.2478/rrlm-2022-0031). In plus, a fost depus pentru evaluare la revista Genes, indexata WEB of Science  (factor de impact 4,141), un manuscris cu rezultate originale intitulat „Autistic behavior as novel clinical finding in OFD1 syndrome”, publicat in luna ianuarie 2023.

In concluzie, in aceasta etapa au fost atinse obiectivele de etapa propuse:

  • A fost finalizata colectia de probe biologice;
  • A fost efectuat protocolul experimental de secventiere de noua generatie a intregului exom si au fost obtinute biblioteci pentru 5 probe biologice, totalizandu-se astfel cele 12 testari in trio propuse si in plus analiza a doi pacienti aditionali;
  • Au fost analizate si interpretate datele de secventiere a intregului exom la 5 pacienti, completand astfel grupul de 14 pacienti testati prin WES prin corelarea datelor cu cele din literatura si cele obtinute de diferite grupuri de specialisti, inclusiv din cadrul consortiului HETEROMICS;
  • A fost evaluat in silico impactul functional al variantelor detectate, utilizand diferite programe de predictie functionala pentru clasificarea contributiei la patogeneza;
  • Au fost comunicate lucrari stiintifice la 4 conferinte europene si o conferinta nationala; a fost publicat un articol original si a fost trimis pentru evaluare un manuscris cu rezultate originale, la o revista indexata in WEB of Science.