COFUND-ERANET E-RARE 3-HETER-OMICS-2, 88/2019
Abordarea multi-OMICS a malformatiilor corticale cerebrale
Valoarea totală a contractului: 585.063,00 lei reprezentând 125.550,00 euro
Perioada de desfasurare: 01/06/2019-31/05/2022
Echipa: Aurora Arghir, PhD; Sorina Mihaela Papuc, PhD; Maria Dobre, PhD; Alina Erbescu
Summary
Heterotopia reprezinta o pozitionare anormala a neuronilor in cortexul cerebral. Heterotopiile sunt boli rare de neurodezvoltare care duc la forme severe de epilepsie si dizabilitate intelectuala. Aceste tulburari formeaza un spectru ce variaza de la grupari neuronale anormale la nivelul ventriculilor cerebrali (periventricular) la heterotopii localizate in substanta alba (subcortical). Pentru a investiga caile specifice, convergente care stau la baza acestor tulburari este foarte importanta intelegerea tipurilor de celule care functioneaza anormal si traiectoriile lor de dezvoltare anormala, precum si caracterizarea consecintelor functionale ale acestora. In plus, acumularea de date clinice si moleculare de la pacienti neinvestigati anterior ofera o perspectiva clinica importanta. Scopul acestui proiect este acela de a caracteriza genetic o cohorta de copii cu heterotopie si de a corela datele genetice cu cele clinice. Acest proiect, prin integrarea multi-dimensionala a datelor, va permite identificarea de noi variante / gene candidate si potentiale surse terapeutice. In plus, familiile acestor pacienti vor beneficia de posibilitatea unei mai bune caracterizari clinico-genetice.
Obiectiv
Caracterizarea genetica comprehensiva a unei noi cohorte de pacienti cu heterotopii si corelarea cu datele clinice si imagistice
Etapa 1 Dec 2019
Malformatiile de dezvoltare corticala cerebrala (MDC) sunt o cauza importanta de epilepsie si intarziere in dezvoltare. Dintre MCD, heterotopiile sunt afectiuni heterogene din punct de vedere genetic, cu o gama larga de defecte raportate, de la microdeletiii si microduplicatii la mutatii punctiforme ceea ce impune utilizarea unui panel de tehnici de investigatie genetica care sa detecteze atat anomaliile cantitative genomice cat si pe cele de secventa.
Obiectivele etapei 1
– Initierea grupului de studiu si a colectiei de probe biologice primare si procesate obtinute de la pacientii cu heterotopie
– Optimizarea protocoalelor experimentale de screening mutational tintit prin secventiere clasica
– Stabilirea protocolului de investigatie genomica prin microarray cromozomial
Metodologiile utilizate si rezultatele obtinute
In etapa actuala au fost efectuate activitati de initiere a bazei de date si colectiei de probe biologice, precum si de configurare si optimizare a testelor moleculare, bazate pe secventiere si microarray. Au fost inclusi in studiu pacienti cu diferite forme de heterotopie, fiind disponibile probe biologice de la probanzi si parintii acestora. Au fost efectuate activitati de procesare preliminara a probelor biologice si izolare ADN. A fost optimizata metoda de secventiere directa pentru analiza de secventa a genelor FLNA si DCX utilizand sistemul pentru electroforeza capilara Applied Biosystems ABI 3500 Genetic Analyzer fiind stabilit protocolul de lucru pentru etapele ulterioare. A fost initiat screening-ul genomic pentru anomalii ale numarului de copii ADN prin hibridizare comparativa genomica bazata pe microarray (array-CGH), efectuata pe platforma Agilent SureScan. Au fost obtinute primele profile genomice cu lame microarray oligonucleotidice de inalta densitate, OGT 4x180K si au fost analizate dezechilibrele genomice.
Concluzii
In aceasta etapa au fost atinse in totalitate obiectivele de etapa propuse.
– A fost initiata baza de date de pacienti cu heterotopii si au fost inregistrate date de la pacientii inclusi pana la data raportarii.
– Au fost stabilite proceduri uniforme de procesare si extractie ADN din probele biologice prelevate si a fost initiata colectia de acizi nucleici din cadrul proiectului.
– Au fost efectuate activitati de optimizare a tehnicii de secventiere Sanger pentru genele FLNA si DCX utilizand ADN control fara modificari la nivelul genelor testate, stabilindu-se protocolul de lucru.
– A fost stabilit protocolul de lucru si a fost initiat screening-ul genomic bazat pe array-CGH.
– Au fost efectuate comunicari stiintifice sub forma a doua postere si o comunicare orala la diferite manifestari stiintifice din domeniul geneticii si neuropsihiatriei (A XI-a Conferinta de Genetica Medicala cu Participare Internationala, Timisoara si A XXVII-a Conferinta Nationala a Asociatiei Romane de Lupta Impotriva Epilepsiei, Bucuresti).
Etapa 2 Dec 2020
Malformatiile de dezvoltare corticala cerebrala (MDC) sunt o cauza importanta de epilepsie si intarziere in dezvoltare. Dintre MCD, heterotopiile sunt afectiuni heterogene din punct de vedere genetic, cu o gama larga de defecte raportate, de la (micro)deletiii si (micro)duplicatii la anomalii de secventa, ceea ce impune utilizarea unui panel de tehnici de investigatie genetica care sa detecteze atat dezechilibrele genomice cat si variatiile de secventa.
Obiectivele etapei 2
– Completarea colectiei de probe biologice
– Screening mutational prin secventierea clasica a genei FLNA
– Screening-ului genomic pentru anomalii ale numarului de copii ADN, bazat pe array CGH
– Optimizarea protocoalelor experimentale de screening mutational prin secventiere de noua generatie a intregului exom
– Diseminarea rezultatelor obtinute
Metodologiile utilizate si rezultatele obtinute
In etapa actuala au fost efectuate activitati de caracterizare genetica a pacientilor inclusi in studiu si de optimizare a unor teste moleculare, bazate pe secventiere de noua generatie a intregului exom.
Au fost continuate activitatile de completare a bazei de date si colectiei de probe biologice prin receptionarea si procesarea probelor biologice de la 10 pacienti cu heterotopii si parintii acestora.
Au fost realizate experimente de microarray cromozomial (lame 4x180k, OGT Constitutional v3) pentru 12 pacienti si au fost identificate un CNV patologic si trei CNV-uri de semnificatie incerta. Screening-ul mutational al genei FLNA a fost realizat prin secventiere clasica Sanger la 3 pacienti, fara a fi detectate variante de secventa patologice sau de semnificatie incerta in ampliconii analizati.
A fost adaptat si optimizat protocolul de lucru pentru secventierea intregului exom, utilizandu-se o metoda de obtinere a librariilor bazata pe PCR, cu kitul AmpliSeq for Illumina Exome Panel. Aceasta metoda permite obtinerea unei acoperiri uniforme inalte si specifice (>90%) cu obtinerea unui volum mare de date (aprox. 59 MB). Pregatirea bibliotecilor pentru secventiere s-a realizat pentru 8 probe biologice provenite de la 3 pacienti si parintii acestora.
Activitatile de diseminare au fost realizate prin participarea la Conferinta Europeana de Genetica Umana cu o lucrare sub forma de poster ( „ Brain malformations diagnosis and clinical management in pediatric patients”) si trimiterea spre publicare la revista Experimental and Therapeutical Medicine a unui manuscris “Clinical and genomic findings in brain heterotopia – report of a pediatric patient cohort from Romania” aflat in prezent in etapa de evaluare, cu decizia de revizie minora.
In plus, in 28-29 ianuarie 2020 a avut loc la Paris intalnirea de lucru a consortiului HETEROMICS, coordonat de Prof Fiona Francis. Institutiile si grupurile de cercetare implicate in consortiu au prezentat materiale de descriere a echipei si temelor de cercetare abordate in general precum si de descriere a activitatilor derulate in prima etapa a proiectului si a gradului de realizare a obiectivelor de faza.
Concluzii
– In aceasta etapa au fost atinse in totalitate obiectivele de etapa propuse.
– A fost completat grupul de studiu si colectia de probe biologice;
– A fost realizat screening-ul mutational prin secventierea clasica a genei FLNA la pacientii cu date clinico-imagistice sugestive si a fost realizata analiza datelor si interpretarea semnificatiei variantelor de secventa detectate;
– A fost realizat screening-ul genomic prin array CGH pentru toti pacientii grupului 1 de studiu si suplimentar pentru 4 pacienti din grupul 2. A fost realizata analiza profilelor genomice si au fost clasificate CNV-urile, pe baza semnificatiei clinice;
– A fost optimizat protocolul experimental de secventiere de noua generatie a intregului exom si au fost secventiate 8 probe biologice;
– Rezultatele activitatilor desfasurate in cadrul proiectului au fost diseminate la evenimente stiintifice si trimise pentru publicare la reviste de profil.
English 
Romanian