Protocol fotodinamic cu porfirine inovative și modulatori redox în patologia cutanată premalignă - demonstrare preclinică

PORPHYDERM

Cod proiect: PN-III-P2-2.1-PED-2021-0360

Număr contract: 637PED/2022

Program: Proiect Experimental Demonstrativ (PED)

Domeniu: 1.3 – Biotehnologii

Durata proiectului: 28.06.2022 – 27.06.2024 (24 luni)

Instituții partenere

Proiectul este implementat de un consortiu multidisciplinar care are o lungă istorie de colaborare și expertiză în dezvoltarea preclinică de porfirine noi pentru PDT, precum și în medicina și terapia redox.

Coordonator: Institutul Național de Cercetare – Dezvoltare în Domeniul Patologiei și Științelor Biomedicale „Victor Babeș”, Director de proiect: CSI Dr. Gina MANDA
Partener 1: Universitatea de Medicină și Farmacie “Carol Davila”, Responsabil partener P1: Prof. Rica BOSCENCU
Partener 2: Biotehnos SA, Responsabil partener P2: CSI Dr. Laura OLARIU.

Buget

Valoarea totală de la buget: 598.795 RON
Valoarea totală a cofinanțării (surse proprii): 53.895 RON
Valoarea totală a Contractului: 652.690 RON

Rezumat

Proiectul are ca obiectiv principal dezvoltarea la nivel preclinic a unui protocol personalizat de terapie fotodinamică (PDT) utilizând fotosensibilizatori porfirinici inovativi și modulatori redox, formulați inteligent pentru tratamentul leziunilor cutanate premaligne, cum ar fi cheratoza actinica (AK). Proiectul se încadrează în tematica Bioeconomie – Biotehnologie.

Aplicația medicală va fi demonstrată utilizând celule și modele de șoareci. Se va investiga atât eficacitatea terapeutică, cât și aspectele toxicologice ale noului protocol PDT. Vom începe proiectul la nivelul TLR 2 – formularea tehnologiei/conceptului de produs, bazându-ne pe un portofoliu de șase brevete și expertiza echipei în domeniul PDT și al medicinei redox. Vom avansa prin TRL 3 – validarea conceptului experimental, prin studii in vitro si ex vivo utilizând linii celulare și explanturi de piele de la șoarece. Ne așteptam să ajungem la sfârșitul proiectului la TLR 4 – validarea în laborator a tehnologiei/metodei, prin testarea în model animal a unui protocol inovativ de keratoliză prin PDT, cu aplicație în AK, care are la bază fotosensibilizatori inovatori si modulatori redox.

OBIECTIVE

Obiective principale

Obiective secundare

SCHEMA STUDIULUI

REZULTATE ESTIMATE

1) Cel puțin 2 compuși porfirinici noi pentru tratamentul cheratozei actinice (AK) cu proprietăți îmbunătățite în comparație cu fotosensibilizatorii comerciali. Sunt de așteptat îmbunătățiri în ceea ce privește amfifilicitatea, fluorescența pentru imagistica in vivo, randamentul semnificativ de oxigen singlet pentru PDT și stabilitatea bună / păstrarea proprietăților fotodinamice în formularea topică a fotosensibilizatorilor.

2) Specificații tehnice pentru toți compușii porfirinici și fitocompușii formulați, precum și pentru protocolul PDT selectat și rezultatul acestuia la șoarecii cu AK.

3) Documentația pentru cel puțin 3 cereri de brevet, depusă la Oficiul Român de Brevete și Mărci.

4) Doi compuși porfirinici înregistrați la Agenția Europeană pentru Produse Chimice.

5) Cel puțin 2 publicații în reviste cu factor de impact > 4 și cel puțin 2 comunicări la congrese relevante din domeniul dermatologiei, toxicologiei și biologiei redox (luăm în considerare că rezultatele asociate brevetului nu trebuie publicate anterior).

6) Un workshop organizat la finalul proiectului pentru prezentarea rezultatelor părților interesate (mediul academic, dermatologi și IMM-uri farmaceutice).

7) Noi servicii de cercetare privind testarea preclinică a noilor strategii PDT în dermatologie, care urmează să fie implementate la: IVB (PDT pe celule tumorale și animale mici de laborator) și la BTH (PDT in vitro pe celule relevante pentru piele, proces tehnologic pentru formularea de porfirine și modulatori redox fotochimici), care urmează să fie publicate în eERIS.

8) Dezvoltare detaliată și strategie de piață, profitând și de Acțiunea COST CA20121 care creează cadrul de colaborare cu IMM-urile farmaceutice din medicina redox și farmaceutică.

9) Pagina web și canale de media dedicate pentru promovarea cunoștințelor generate în proiect către specialiști, industria farmaceutică și publicul larg.

REZUMATUL ETAPEI I/2022

Sinteza și caracterizarea preliminară a noilor compuși porfirinici

Statisticile recente evidențiază cancerul ca principală cauză de deces la nivel mondial, prevăzând o creștere a numărului de cazuri față de anul 2020 cu 47% până în anul 2040 [1,2]. Din aceste considerente dezvoltarea de strategii inovative privind diseminarea măsurilor de preventie și furnizarea de substanțe active cu potențial antitumoral sunt esențiale pentru combaterea cancerului la nivel mondial. Leziunile non-melanom (keratoze actinice, carcinom spinocelular și bazocelular, limfom cutanat, sarcom Kaposi, angiosarcom) sunt printre cele mai frecvente forme de cancer. Dezvoltarea unui cancer non-melanom este determinată de factori genetici, istoric de infecție HPV, istoric de afecțiuni cutanate inflamatorii cronice, expunere la substanțe toxice, la soare, imunosupresie, fototipurile cutanate I și II, PUVA ca terapie anterioară [3, 4]. Keratozele actinice sunt descrise in literatura sub forma de ,,carcinom in situ” (din cauza keratinocitelor displazice asemănătoare cu carcinomul cu celule scuamoase) sau ca leziune premalignă [5]. Abordarea terapeutica în cazul keratozei actinice trebuie să ținteasca scăderea riscului de malignizare și un diagnostic precoce al formațiunilor maligne care pot apărea într-un camp de keratoză actinică. Porfirinele, prin profilul lor structural si spectral, au potential în identificarea și terapia manifestărilor cutanate de tip malign [6]. În plus, avantajul major al acestor tipuri structurale asemănătoare hemului este selectivitatea pentru celule tumorale și versatilitatea lor, posibilitatea modelării structurale prin atașare de substituenți cu diferite grade de polaritate, pentru obtinerea unui raport hidrofil/lipofil optim pentru internalizarea celulară.

In acest context, obiectivul principal al proiectului este de a elabora un protocol pentru terapia fotodinamica (PDT) a keratozei actinice, utilizand noi derivati porfiriniici. Activitatile din cadrul proiectului includ evaluarea potentialului de marker si agent antitumoral al unor compusi porfirinici cu arhitectura moleculara asimetrica si profil spectral adecvat. O primă etapă a proiectului prevede obținerea de noi structuri porfirinice, prin tehnici ecologice de sinteză care respectăa cerințele actuale din domeniul sintezei medicamentului. S-a urmărit obținerea unui set de date asociate procedurilor de sinteză și parametrilor care definesc profilul structural al noilor fotosensibilizatori.

In cadrul Activitatii I.1 realizată de UMF au fost obținuti următorii compuși porfirinici:

cu structuri asimetrice:

5-(2,4-dihidroxifenil)-10,15,20-tris-(4-acetoxi-3-metoxifenil) porfirina (2)
5-(2-hydroxi-3-metoxifenil)-10,15,20-tris-(4-carboximetilfenil) porfirina (P 5.2)

cu structuri simetrice (referință pentru derivații asimetrici în studiile in vitro)

5,10,15,20-meso-tetrakis-(4-acetoxi-3-metoxifenil) porfirina (P4.1º1)
5, 10,15,20-tris-(4-carboximetilfenil) porfirina (P 5.1)

Evaluarea structurală și spectrală a compușilor sintetizați s-a realizat în Activitatea I.1 prin analiza RMN, FTIR, UV-Vis și fluorescență. Corelarea datelor obținute a confirmat structurile compușilor porfirinici sintetizați în această etapă. Concluzionând, studiile preliminare au condus la obtinerea, cu randamente bune, a 4 compusi porfirinici prin abordarea unei metode de sinteza moderne si ecologice.

În Activitatea I.2 au fost analizate 3 tipuri de formulări pentru aplicații topice ale compușilor porfirinici și modulatorilor, întro primă etapă fiind selecționată și detaliată metoda în gel.

Studiul in vitro realizat în Activitatea I.3 a arătat că toți compușii porfirinici analizați, evaluați in vitro pe celule normale și tumorale specifice pielii (keratinocite umane normale HaCaT, fibroblșsti umani dermici HS27 și celule de mealnom de șoarece B16F10) au avut o bună biocompatibilitate cu celulele normale și tumorale de piele. Se remarcă totuși următoarele aspecte: 1) compusul P5.2 poate inhiba multiplicarea keratinocitelor, ceea ce are relevanță terapeutică în cazul keratozei actinice caracterizată prin hiper-proliferarea acestor celule, dacă se evită fotosensibilizarea temporară a pielii; b) compușii P2.1 și P5.2, dar nu și derivatul porfirinic P4.2, determină creșterea eliberării LDH de către fibroblaștii dermici, posibil datorită unor efecte nedorite care perturbă integritatea membranară a fibroblaștilor dermici.

Toți compușii porfirinici analizați s-au incorporat în celulele normale și tumorale de piele investigate, este adevărat cu intensități diferite, dovedind astfel proprietăți de marcator fluorescent. Compușii porfirinici P2.1 și P4.2 pot fi considerați candidați pentru imagistică de fluorescență în dermatologie, și pentru PDT în dermatologia oncologică.

Pentru vizibilitatea proiectului și a realizărilor sale, în Activitatea I.4 a fost realizată pagina web a proiectului, care se găseste la adresa

https://www.ivb.ro/porphyderm

În Activitatea I.5, coordonată de UMF a fost elaborată cererea de brevet de invenție cu titlul ,,Compus porfirinic cu potential de marcator fluorescent in dermato-oncologie”, la care au participat toți partenerii. Documentatia tehnică a cererii de brevet revendică elemente de noutate corespunzatoare obținerii, evaluării spectrale și biologice a compusului 5-(2-hydroxi-3-metoxifenil)-10,15,20-tris-(4-carboximetilfenil) porfirina (P5.2). Cererea de brevet de invenție a fost înregistrată la OSIM.

Obiectivul și activitățile etapei I au fost realizate 100%.

REZUMATUL ETAPEI II/2023

Studiu preclinic intermediar

Activitățile etapei II

Activitate	Partener
Activitatea II.1 Sinteza si caracterizarea unor compusi porfirinici pentru studiile preclinice	UMF (P1)
Activitatea II.2 Obtinerea, formularea si caracterizarea unor fitocompusi	BTH (P2)
Activitatea II.3 Studiu biologic in vitro	IVB (CO)
Activitatea II.4 Formularea compusilor porfirinici si a modulatorilor redox pentru aplicatie topica	BTH (P2)
Activitatea II.5 Studiu biologic ex vivo pe explanturi de piele	BTH (P2)
Activitatea II.6 Realizarea si caracterizarea modelelor animale de cheratoza actinica	IVB (CO)
Activitatea II.7 Studiu preliminar in vivo in model animal	IVB (CO)
Activitatea II.8 Evaluarea homeostaziei pielii in model animal de cheratoza actinica cu diverse tratamente	BTH (P2)
Activitatea II.9 Diseminarea rezultatelor: actualizarea paginii web, articole, comunicări, parteneriat internațional.	IVB (CO) UMF (P1)

Rezultatele etapei II

Rezultate estimate	Rezultate realizate
2 compusi porfirinici selectati si specificatii tehnice intermediare	3 compusi porfirinici cu specificatii tehnice: P2.1, P2.2 și P4.2 (Anexa 1)
2 fitocompusi cu specificatiile lor tehnice	2 fitocompusi cu specificatii tehnice (Activitatea II.2 si Anexa 2)
1 raport final de studiu biologic in vitro	Raport de studiu preliminar in vitro (descris la Activitatea II.3. Rezultatele sunt prezentate in articolul publicat in revista ISI (Anexa 3 si Anexa 9-articol submis pentru publicare)
1 raport de studiu intermediar pe explanturi de piele	• Metoda de obtinere si testare explanturilor de piele in vederea studiilor de difuziune verticala a preparatelor topice si transdermice (vezi si Anexa 5.1); • Metoda HPLC pentru compusi porfirinici; • Protocol de realizare a PDT pe explanturi de piele (Anexa 5.2).
2 compusi porfirinici și 2 fitocompusi formulati pentru aplicatie topica	Variante de geluri pentru formularea topica a fotosensibilizatorilor si a fitocompusilor pentru PDT la nivelul pielii (Activitatea II.4, Anexa 4)
1 protocol de PDT ex vivo pe explanturi de piele	Protocol de PDT ex vivo pe explanturi de piele (Anexa 5)
2 modele animale de cheratoza actinica	2 modele animale caracterizate (expunere repetata la UVB, tumori transplantabile de celule de carcinom uman de piele cu celule scuamoase in soareci nuzi imunosupresati); Un al treilea model este in curs de realizare (carcinogeneza chimic indusa in soareci FAV). Vezi Activitatea II.6 si Anexa 6.
1 raport de studiu preliminar in vivo	Raport de studiu preliminar in vivo pe soareci C57BL/6 expusi repetitiv la doze crescatoare de UVB si tratati in vivo cu (Activitatea II.7).
Panel de gene tinta ale NRF2	Panel de gene tinta ale NRF2, relevant pentru terapia fotodinamica (Anexa 7.1)
1 protocol de terapie combinată PDT și modulare redox in model preclinic	1 protocol de terapie combinată PDT și modulare redox in model preclinic (Anexa 7.2)
1 procedură de investigare a pielii in vivo	Procedura de investigare a pielii in vivo (Activitatea II.8 si Anexa 8)
1 pagina web actualizată	PORPHYDERM – National Institute of Pathology Victor Babeş – Bucharest (ivb.ro)
2 comunicari stiintifice	· 1 comunicare stiintifica la Conferinta Stiintifica de toamna a AOSR 2023 cu titlul ”Știința pentru o societate sănătoasă”, organizata in perioada la 21-23.09.2023 Universitatea OVIDIUS din Constanța; · 1 prezentare orala in domeniul factorului de transcriptie NRF2 in cancer la Cursul „NRF2 in Noncommunicable Diseases: from Bench to Bedside”, organizat in cadrul Actiunii COST CA20121 in perioada 26-30.06.2023 la smolenice Castle, Slovacia.
2 articole stiintifice publicate	· 1 articol publicat in anul 2023 la revista Molecules (ISI, factor de impact 2023 4.927); · 1 articol depus pentru publicare in revista Pharmaceuticals (ISI, factor de impact 5.215).
2 cereri de brevet depuse la OSIM	· 1 cerere de brevet a fost depusă la OSIM cu nr. de înregistrare A/00775/28.11.2022 și cu titlul ,,Compus porfirinic cu potential de marcator fluorescent in dermato-oncologie” (depunere raportata în avans în etapa I) · Pentru unul dintre compusii testati in cadul acetsei etape a fost acordat berevetul No. 132752 B1, publicat in RO-BOPI, 11 din 29.11.2023, cu titlul „ Porphyrin derivative for theranostic use”, autori: Rica Boscencu, Gina Manda, Radu Petre Socoteanu, Mihail Eugen Hinescu, Ionela Victoria Neagoe, Laura Olariu, Brandusa Dumitriu.
1 cerere de brevet in curs de elaborare	1 cerere de brevet este in curs de elaborare privind formularea fotosensibilizatorilor selectionati in etapele 1 si 2 ale proiectului pentru aplicatie topica in PDT.
2 protocoale de colaborare cu experti din strainatate	3 protocoale de colaborare cu experti din strainatate